偽狂犬病病毒gD基因核酸疫苗及VP22免疫增強效應的研究.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies)是當今危害養(yǎng)豬業(yè)的最重要傳染病之一，雖然一些國家實施了根除計劃，但在絕大多數(shù)國家尤其是發(fā)展中國家，該病仍然頻繁發(fā)生，造成的經(jīng)濟損失巨大，嚴重制約著這些國家和地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。免疫接種仍是目前控制和預防該病的主要手段。傳統(tǒng)的豬偽狂犬病疫苗對控制疾病的發(fā)生和流行發(fā)揮了巨大作用，但無論是滅活疫苗還是弱毒疫苗均不同程度的存在免疫效果不佳或毒力返強等缺陷。研制更安全、高效、廉價的新型疫苗一直是偽狂犬病研究的重要

2、方向。 本研究在克隆、表達豬偽狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PrV)鄂A株的主要免疫原性基因gD的基礎上，構建了這一基因的真核表達質粒并作為核酸疫苗，通過肌肉注射的方式免疫試驗動物，檢測了動物產(chǎn)生的免疫應答水平以及對病毒攻擊的保護能力，結果證實這些核酸疫苗可以有效激活試驗動物產(chǎn)生全面的免疫應答反應。同時還研究證明偽狂犬病毒VP22對豬偽狂犬病核酸疫苗具有免疫增效作用。主要研究內(nèi)容如下： 1.PrVEa株

3、gD基因、VP22基因的克隆分別以重組質粒pcDD和pMD-VP22為模板，設計引物，通過PCR擴增，在gD基因的上、下游引入HindⅢ和PstⅠ位點，在VP22基因的上、下游引入XbaⅠ和EcoRⅠ位點，將擴增的gD基因和VP22基因基因片段克隆到載體pUC119，構建質粒pUC-gD、pUC-VP22和pUC-gD-VP22；并將pUC-gD、pUC-VP22送上海博亞生物工程公司測序。酶切電泳鑒定，gD基因片段長度約為1200bp

4、，VP22基因片段長約760bp，gD-VP22基因片段長約2000bp；測序結果表明，擴增的gD基因片段為1266bp，VP22基因片段756bp，gD-VP22基因片段為2028bp。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)擴增的gD基因、VP22基因與GeneBank中公布的PrV的gD基因(AF086702)和VP22基因(AY190527)標準序列一致，在PCR擴增過程中沒有發(fā)生堿基突變。 2.表達質粒的構建使用核酸內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRI,酶

5、切攜帶目基因片段的pUC-gD、pUC-gD-VP22及原核表達載體pET28a(+)和真核表達載體p3XFLAG-CMVTM-10，連接、構建原核表達質粒pET-gD、pET-gD-VP22以及真核表達質粒p3XFLAG-gD、p3XFLAG-gD-VP22。原核表達質粒、真核表達質粒分別酶切電泳后，分別在1300bp處和2000bp附近均出現(xiàn)了明亮的條帶，結合序列鑒定結果，可以表明目的基因已經(jīng)插入到表達載體的多克隆位點處。

6、3.gD基因在大腸桿菌中的高效表達原核表達質粒pET-gD和pET-gD-VP22分別轉化BL21(DE3)細胞，IPTG誘導，SDS-PAGE結果顯示：pET-gD能夠在大腸桿菌中表達出約47kD的蛋白，pET-gD-VP22能夠在大腸桿菌中表達出約72kD的融合蛋白，Westernblot結果表明以上兩種原核表達蛋白具有良好的反應原性。 4.Prv-gD基因DNA疫苗的免疫保護，及VP22蛋白免疫增強作用將以p3XFLAG為

7、載體，構建的gD基因真核表達質粒p3XFLAG-gD和p3XFLAG-gD-VP22，以100μg/只免疫BALB/c小鼠，間隔15天增強免疫一次，二免4周后采用5×105pfu的PrVEa株強毒攻擊，p3XFLAG-gD-VP22免疫組和p3XFLAG-gD免疫組DNA疫苗對小鼠的保護率分別為87.5﹪和75﹪。 將表達gD-VP22融合蛋白的質粒p3XFLAG-gD-VP22免疫小鼠，與非融合表達質粒p3XFLAG-gD進行

8、比較，間接ELISA檢測發(fā)現(xiàn)與VP22融合表達能顯著增強特異性IgG水平。通過對小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細胞百分含量分析發(fā)現(xiàn)，p3XFLAG-gD-VP22和p3XFLAG-gD免疫組CD4+和CD8+T淋巴細胞百分含量均極顯著高于空載體組和空白對照組，且p3XFLAG-gD-VP22免疫組小鼠外周血中CD4+T細胞的數(shù)量顯著高于p3XFLAG-gD免疫組(P＜0.05)，可見融合基因p3XFLAG-gD-VP22質粒能夠誘