利用基因編碼的非天然氨基酸研究甲酸化及甲?；嚢彼岱g后修飾.pdf

1、U n i v e r s i t y o fS c i e n c e a n d T e c h n o l o g y o fC h i n aA d i s s e r t a t i o nf o rd o c t o r ’Sd e g r e eA u 曲o r ' sN a m e ：T i a n y u a n W a n gs p e c i a l i t y ： E n v i r o n m e n

2、t a lS c i e n c ea n d E n g i n e e r i n gP r o f ．R e n b i n Z h u ，P r o f ．X u e b i n Y i nF i n i s h e dt i m e ： M a y 4 山，2 0 15W Ⅳd 黜M 協(xié)甜- I 唰G 腫 №嶼№ 抓?舢Cm 響 黼 y 憐岫 ?。甿 ⅪUSK 郵例眥Sq E 乳b 臥摘要摘要近十幾年來，基于基因密碼子擴展的非

3、天然氨基酸( u A A ) 技術得到了廣泛的應用。通過這項技術，我們可以實現將目標U A A 特異性地插入到目標蛋白的任意位點，其應用范圍非常廣闊，包括原核生物一一細菌，真核生物——酵母、哺乳動物細胞、真核生物體( 如線蟲) 、高等植物( 如擬南芥) 等。利用這種方法已經有超過i 0 0 種的U A A 被基因編碼到不同的系統(tǒng)中，利用u 從本身的性質以及u 從與蛋白的相互作用實現了多種多樣的用途，如蛋白的位點特異性標記，具有生物學意義

4、的核磁、紅外、F R E T 、熒光探針，改造并提高蛋白的酶活，向蛋白的特定位點引入翻譯后修飾研究其功能等。U A A 插入蛋白的特異性翻譯系統(tǒng)依賴于吡咯賴氨酸氨酰t N R A 合成酶( P y l R S ) 底物結合口袋對U A A 的特異性識別作用，我們將底物結合口袋的關鍵位點進行隨機突變，構建了P y l R S 的突變庫，通過正負篩選的策略篩選出能夠識別目標U A A 的氨酰t R N A 合成酶，然后利用正交翻譯系統(tǒng)將U

5、A A 插入到需要研究的蛋白的特定位點，進一步研究蛋白的性質或結構的變化。C O 。的生物固定是地球上的生命賴以生存的基礎，r u b i s c o 是固碳開爾文循環(huán)第一步反應中起催化作用的酶，同時也是固碳的限速步驟。其蛋白結構中存在一個重要的翻譯后修飾一一c a r b 鋤a t el y s i n e ( K c x ) ，起著固定并激活M 9 2 +的作用。我們首次通過U A A 的方法研究了這一翻譯后修飾的功能，并希望能夠提

6、高r u b i s c o 的酶活，進而提高光合作用的效率，達到增加糧食產量的目的。首先我們設計了一系列K c x 的結構類似物，通過引入苯酯保護或光保護的羧基保護基策略，找到了能夠識別此U A A 的P y l R S 突變體，并且成功將K c x 結構類似物插入了r u b i s c o 蛋白的1 8 9 位點，以模擬K c x 的作用。結果表明含有此K c x結構類似物的r u b i s c o 活性幾乎全部喪失，這說明K

7、c x 對于r u b i S C O 的功能是不可或缺的，其側鏈上氨基的作用可能比之前預想的更加重要。甲酰化賴氨酸是一種新的翻譯后修飾，廣泛存在于真核生物染色體的組蛋白中。這種翻譯后修飾可能對于染色質結構和基因表達的調控具有重要作用，但并未得到詳細的研究，原因之一在于缺乏位點特異性地將甲酰化賴氨酸引入特定蛋白的方法。我們首次通過人工篩選的方法進化出了能夠識別甲酰賴氨酸的P y l R S 克隆，通過基因密碼子擴展的方法將甲酰賴氨酸引入