小鼠裸卵發(fā)育潛力及其來源的研究.pdf

1、卵母細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育和成熟是現(xiàn)代生殖生物學(xué)研究的核心和基礎(chǔ)，其中，卵母細(xì)胞的成熟是生殖發(fā)育研究的難點和重點。影響卵母細(xì)胞成熟的因素很多，其中卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞是影響卵母細(xì)胞成熟的核心要素，裸卵是指周圍未經(jīng)卵丘細(xì)胞完整包裹的卵母細(xì)胞，尚未被利用，是一種潛在的卵源。裸卵體外成熟率及后續(xù)發(fā)育潛力較低。目前未見裸卵體外成熟獲得個體的報道，這不僅制約著裸卵體外成熟培養(yǎng)的進(jìn)一步發(fā)展，也制約著卵母細(xì)胞資源的充分利用。Forskolin能夠抑制卵母細(xì)

2、胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，而PD166285能夠推動MPF的合成，從而促進(jìn)減數(shù)分裂的恢復(fù)。紡錘體的組裝及皮質(zhì)顆粒的分布可作為評價卵母細(xì)胞質(zhì)量的指標(biāo)。哺乳動物卵母細(xì)胞的發(fā)生，是一個極為復(fù)雜的細(xì)胞分化過程，易受到外界環(huán)境的影響。應(yīng)激尤其是熱應(yīng)激對個體產(chǎn)生的最大問題之一就是它對生殖功能的損傷作用。但是熱應(yīng)激對卵母細(xì)胞質(zhì)量，卵丘細(xì)胞包裹、凋亡情況以及裸卵的產(chǎn)生關(guān)系未見相關(guān)報道。因此，本研究以小鼠為研究對象，通過短時添加forskolin以抑制胞核成熟進(jìn)

3、程，再添加PD166285促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)，觀察forskolin及PD166285對卵母細(xì)胞成熟效率，并檢測成熟卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒分布及紡錘體組裝，觀察其對卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響。并通過IVF-ET進(jìn)一步檢測體外成熟裸卵的后續(xù)發(fā)育能力。并對小鼠進(jìn)行熱應(yīng)激處理，通過蘇木精伊紅染色法及TUNEL細(xì)胞凋亡檢測法觀察卵巢上卵母細(xì)胞包裹的卵丘細(xì)胞的衰退與凋亡的情況，試圖揭示熱應(yīng)激與小鼠卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞質(zhì)量衰退，裸卵產(chǎn)生之間的聯(lián)系。具體試驗和結(jié)果如下：

4、
　　試驗一目的是探討添加forskolin及PD166285對裸卵成熟效率及皮質(zhì)顆粒分布、紡錘體組裝影響。將體外取得的未成熟的GV期裸卵隨機(jī)分配為添加forskolin、PD及不添加兩組。統(tǒng)計不同成熟方式下裸卵的成熟率，隨后檢測成熟卵母細(xì)胞紡錘體組裝及皮質(zhì)顆粒分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加藥組不加藥組均能完成體外成熟過程，加藥組裸卵體外成熟率高于不加藥組；對照組卵母細(xì)胞，其紡錘體呈對稱的“紡錘形”。不加藥組紡錘體結(jié)構(gòu)松散，呈“桶狀”分布，體

5、內(nèi)成熟組，皮質(zhì)顆粒皮層分布模式所占比例顯著高于體外成熟各組。以上結(jié)果說明，添加forskolin及PD166285能夠提高裸卵的體外成熟率，并對成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量有一定提升。
　　試驗二旨在探明裸卵通過體外成熟受精后生產(chǎn)小鼠的可能。將卵巢上獲取的裸卵體外加藥培養(yǎng)成熟，并通過體外授精技術(shù)使其受精并發(fā)育到2-細(xì)胞期后，將2-細(xì)胞胚胎通過輸卵管胚胎移植法移入假孕0.5dpc的受體雌鼠體內(nèi)，并使其繼續(xù)發(fā)育。我們通過本試驗首次獲得了由裸卵體外

6、成熟受精生產(chǎn)出的小鼠。證明裸卵具有發(fā)育為個體的潛力。
　　試驗三旨在揭示熱應(yīng)激與小鼠卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞質(zhì)量衰退及裸卵的產(chǎn)生之間的聯(lián)系。將小鼠均分為HS-12d、HS-9d、HS-6d、HS-3d及CON五組，每組12只，分別對其進(jìn)行頻率和時間不同的高強(qiáng)度熱應(yīng)激。處理完成后，制作卵巢石蠟切片。利用HE染色及TUNEL細(xì)胞凋亡檢測觀察小鼠卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞個數(shù)及其包裹的卵丘細(xì)胞的衰退與凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組卵母細(xì)胞個數(shù)顯著高于各熱處理組，

7、差異均顯著(P＜0.05)。卵巢上周圍卵丘細(xì)胞包裹2-5層的卵母細(xì)胞數(shù)量，對照組要顯著高于其與各實驗組(P＜0.05)。TUNEL凋亡檢測顯示，對照組凋亡率要顯著低于各熱應(yīng)激處理組，差異均顯著(P＜0.05)。結(jié)果表明，熱應(yīng)激會導(dǎo)致裸卵的產(chǎn)生。
　　綜上所述，本文通過裸卵體外成熟過程中與forskolin、PD166285共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)添加forskolin及PD166285能夠提高裸卵的體外成熟率，并對成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量有一定提升，