皮寒藥對金黃色葡萄球菌的抑制作用及其抑菌機制研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為一種食源性致病菌，不僅嚴重威脅著食品衛(wèi)生安全，而且在動物生產(chǎn)上也具有嚴重的危害性。在醫(yī)學和獸醫(yī)學臨床上，金葡菌往往引起人類和動物化膿性感染。隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicilin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）臨床檢出率不斷升高，由其引起的感染現(xiàn)已成為全球性的衛(wèi)生難題。從天然藥物中尋找有效抗金黃色葡萄球菌的物質是近年來

2、抗菌藥物研發(fā)的一個方向。
　　皮寒藥是川滇米口袋（Gueldenstaedtia delavayi Franch）的干燥全草，《西昌中草藥》記載其：“全草入藥，四季可采；性寒，味辛苦，清熱解毒、鎮(zhèn)痛”，是四川攀西地區(qū)特色藥用資源，在當?shù)卦撍幹饕糜谙飧屑膊?，具有藥食兩用的價值。迄今，對皮寒藥的研究報道較少，僅對其藥效學和活性成分進行了部分研究。本課題通過提取分離皮寒藥不同部位藥物，以金黃色葡萄球菌為研究對象，篩選皮寒藥抑制金黃

3、色葡萄球菌生長的有效部位，并研究皮寒藥有效部位抗菌作用機理。主要試驗結果及結論如下：
　　1．皮寒藥幾種不同部位對金黃色葡萄球菌抑菌活性研究
　　利用有機溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分離提取皮寒藥不同部位，采用微量肉湯稀釋法測定皮寒藥不同部位對金葡菌質控菌株ATCC25923和甲氧西林敏感金葡菌（Methicilin-susceptible Staphylococcu saureus，MSSA）臨床分離株RC-1、RC-3、

4、RC-5及耐甲氧西林金葡菌臨床分離株DZ-1的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。結果表明，皮寒藥正丁醇部位和水相部位對金葡菌生長無明顯影響。石油醚部位和乙酸乙酯部位均能不同程度抑制金葡菌質控菌株和臨床分離株的生長，其 MIC分別為15 mg·mL-1和7.5 mg·mL-1，MBC分別為30 mg·mL-1和15 mg·mL-1，結果顯示皮寒藥乙酸乙酯部位具有更好的抑菌活性。通過對皮寒藥乙酸乙酯部位幾種不同濃度藥物下金葡菌

5、在不同時間點的菌落計數(shù)，繪制金葡菌的生長曲線，試驗發(fā)現(xiàn)1 MIC藥物組菌液濃度在2、4、6、10、24 h五個時間點極顯著低于菌液對照組和1/4 MIC藥物組（P＜0.01），在4、6、10、24 h四個時間點，極顯著低于1/2 MIC藥物組。1/2倍MIC藥物組菌液濃度在2、4、6、10 h四個時間點極顯著低于菌液對照組（P＜0.01），在2、4、6 h極顯著低于1/4 MIC組。1/4倍MIC藥物組菌液濃度在2、4、10 h三個時間

6、點顯著低于菌液對照組（P＜0.01）。結果提示：皮寒藥石油醚部位和乙酸乙酯部位能抑制MSSA和MRSA的生長，與石油醚部位相比，乙酸乙酯部位顯示出更好的抑菌活性，且抑菌效果與藥物濃度呈正相關。
　　2．皮寒藥乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑菌機理研究
　　通過測定金葡菌胞外堿性磷酸酶含量、培養(yǎng)液電導率、葡萄糖含量變化、糖代謝相關酶活及菌體可溶性蛋白含量變化，從皮寒藥乙酸乙酯部位對菌體細胞壁膜通透性、能量代謝、可溶性蛋白質合成三

7、個方面研究藥物對金葡菌的抑菌機理。結果顯示，MBC藥物濃度下，金葡菌培養(yǎng)液電導率不發(fā)生變化，胞外堿性磷酸酶活性在藥物處理后1h和3h內顯著高于菌液對照組（P＜0.05）。結果表明皮寒藥乙酸乙酯部位對金葡菌細胞膜滲透性無影響，在藥物作用前期，可增大細胞壁的通透性。對葡萄糖含量變化測定結果顯示，1 MIC、1/2 MIC和1/4 MIC藥物濃度組培養(yǎng)液中所剩葡萄糖含量在4 h、6 h、8 h顯著高于0 MIC（P＜0.01）。0 MIC組金

8、葡菌在6 h內消耗完培養(yǎng)液中的葡萄糖，而1/2 MIC和1/4 MIC組在10 h后消耗完畢，1 MIC組10 h后培養(yǎng)液中仍含有葡萄糖。結果表明皮寒藥乙酸乙酯部位的1 MIC、1/2 MIC和1/4 MIC三個藥物濃度能顯著抑制金葡菌對葡萄糖的利用。對糖代謝相關酶活的檢測結果顯示，在第1 h、3 h、5 h三個時間點1 MIC藥物組琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶活性均低于0 MIC組，其中乳酸脫氫酶活性在這兩組間差異極顯著（P＜0.01），

9、琥珀酸脫氫酶活性在第1 h和3 h兩個時間點兩組間差異極顯著（P＜0.01）。結果表明皮寒藥乙酸乙酯部位1 MIC濃度藥物可極顯著抑制金葡菌乳酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶的活性。對金葡菌可溶性蛋白含量的檢測結果顯示，在3 h、5 h、7 h三個檢測時間點，1 MIC藥物組金葡菌可溶性蛋白濃度均低于菌液對照組，在3 h、5 h兩個檢測時間點差異極顯著（P＜0.01），在第7 h差異顯著（P＜0.05）。第3 h，1 MIC組菌體可溶性蛋白濃度比

10、菌液對照組降低了42.54%，第5 h降低了17.78%，第7 h降低了15.87%。結果表明皮寒藥乙酸乙酯部位1 MIC濃度藥物能抑制金葡菌可溶性蛋白質的表達。試驗結果提示：皮寒藥乙酸乙酯部位能干擾金葡菌的能量代謝過程和可溶性蛋白質的表達，在藥物作用前期能影響菌體細胞壁通透性。
　　3．皮寒藥乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用的轉錄組學分析
　　本研究通過對皮寒藥乙酸乙酯部位作用組和正常對照組的金葡菌轉錄本信息進行測序比

11、較，結果共獲得195個差異表達基因（FC≥2，P＜0.05），與對照組相比，皮寒藥作用組金葡菌轉錄本中101個基因表達上調，94個基因表達下調。其中皮寒藥作用組金葡菌的蛋白質合成相關基因：50S核糖體蛋白質L27、50S核糖體蛋白質L25、50S核糖體蛋白L15、核糖體RNA大亞基甲基轉移酶、延伸因子G基因表達顯著下調（P＜0.05）。有14個差異表達基因顯著富集在氨基酸生物合成過程，其中5個與天冬氨酸鹽家族氨基酸生物合成過程有關，基因

12、 lysC（編碼天冬氨酸激酶）、thrC（編碼蘇氨酸合酶）、metE（編碼同型半胱氨酸-S-甲基轉移酶）、dapH（編碼N-琥珀酰轉移酶）表達上調，基因lysA（編碼二氨基二庚酸脫羧酶）表達下調。嘌呤生物合成過程中，編碼次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶基因、脫氧鳥苷激酶基因、甘氨酸連接酶基因表達下調，同時，催化嘌呤核苷磷酸解反應的嘌呤核苷磷酸化酶基因表達上調。此外，葉酸生物合成過程中聚谷氨酸合成酶、嘧啶代謝過程中的嘧啶核苷磷酸化酶基因均表達下調。

13、測序結果顯示差異基因在果糖-甘露糖代謝途徑存在顯著富集，果糖-二磷酸醛縮酶和L-艾杜糖醇-2-脫氫酶基因表達下調。ABC轉運家族成員亞精胺/腐胺ABC轉運蛋白、寡肽ABC轉運蛋白、鐵復合物轉運蛋白、鐵/鋅/錳/銅轉運蛋白、鎳轉運蛋白、磷壁酸轉運蛋白的跨膜通道蛋白基因表達上調。細胞壁合成相關基因，mrcA（編碼青霉素結合蛋白1A）、murB（編碼UDP-N-乙酰胞壁酸脫氫酶）、sgtA（轉糖苷酶基因）、tagB（編碼磷壁酸生物合成蛋白質）

14、表達上調。此外，多種毒力因子：表皮剝脫毒素A（Exfoliative toxin A）、凝集因子（Clumping factor）、殺白細胞素（Pantonvalentine leucocidin，PVL）以及與多糖細胞間黏附素（Polysaccharide intercellular adhesion，PIA）形成具有密切聯(lián)系的icaR、icaC基因均表達下調。以熒光定量PCR對10個差異表達的基因進行驗證。結果顯示這些基因的表達變化

15、趨勢與轉錄組測序分析結果基本一致。試驗結果表明皮寒藥作用于金葡菌1 h，差異表達基因主要集中在代謝過程、催化活性、細胞過程、蛋白結合和毒力因子表達上。提示皮寒藥可下調金葡菌相關毒力因子的表達，上調細胞壁合成相關基因的表達，影響氨基酸代謝、糖代謝、嘌呤嘧啶代謝過程相關酶基因的表達，并可能通過下調金葡菌核糖體相關編碼基因及延伸因子的基因表達干擾菌體細胞蛋白質的合成過程。
　　綜上，本研究表明皮寒藥乙酸乙酯部位對金葡菌具有抑菌和殺菌活性