P2X-NMDA受體參與經(jīng)顱直流電刺激對神經(jīng)病理性痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是由于中樞或者外周神經(jīng)病理性改變引起的頑固性疼痛，主要特征為自發(fā)性疼痛（spontaneous pain）、痛覺過敏(hyperagesia)及痛覺超敏(allo dynia)。臨床上，雖然藥物治療NPP已取得了較好的療效，但是由于NPP發(fā)病機制復雜，仍有部分病人疼痛控制效果不佳，長期大量使用藥物控制NPP可能會出現(xiàn)藥物的副作用或臟器功能的損害，并給患者帶來沉重

2、的經(jīng)濟負擔。近年來基于神經(jīng)調控的介入治療被逐步應用到各種頑固性疼痛的治療，并取得了理想的治愈效果。經(jīng)顱直流電刺激（Transcranial Direct Current Stimulationt，tDCS）是一種安全、無創(chuàng)、非侵入式的神經(jīng)調控新技術，利用微弱的直流電作用于顱骨表面特定的靶向區(qū)域，使大腦皮層發(fā)生可塑性的改變;已經(jīng)被證實可有效緩解纖維背痛、術后疼痛、脊髓損傷后疼痛等難治性疼痛。tDCS的鎮(zhèn)痛機制尚不明確，但是其鎮(zhèn)痛效果受刺激

3、電極的極性、大小、刺激電極埋置的靶向位置等客觀因素的影響，同時也與患者的病程及刺激的干預次數(shù)等主觀因素有關，研究還發(fā)現(xiàn)谷氨酸、γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質參與了tDCS對皮層的可塑性調控，抑制皮層NMDA受體可以削弱tDCS產生的后效應。
　　P2X受體屬于嘌呤能離子通道型受體，在慢性疼痛的傷害性信息傳遞中起重要作用。當機體受到傷害性刺激時，大量ATP從受損神經(jīng)末梢釋放，與細胞膜上的P2X受體結合，引起陽離子大量內流導致細胞去極化，同時

4、P2X受體還通過與谷氨酸相互作用進一步激活疼痛通路，許多研究證實谷氨酸NMDA受體活化與痛覺中樞敏感化的產生和維持有關;在脊髓以上水平，尤其是在中樞NMDA受體和P2X3受體卻發(fā)揮著完全相反的作用，激活NMDA受體和P2X3受體可以產生鎮(zhèn)痛效果。
　　中腦導水管周圍灰質(periaqueductal gray，PAG)是機體疼痛調制系統(tǒng)的重要位置，在上行調控的過程中參與將脊髓和延髓的傷害性信息投射至更高級中樞，同時還發(fā)出纖維參與高

5、位中樞對疼痛的下行調控，研究PAG腦區(qū)對疼痛信息的調控，有助于了解tDCS鎮(zhèn)痛的機制。推測tDCS通過刺激大腦皮層，促進皮層神經(jīng)元可塑性改變，進而投射至PAG并激活相關的下行抑制通路，產生鎮(zhèn)痛作用;而NMDA受體和P2X3受體則參與了tDCS對皮層及PAG疼痛信息的加工。
　　本課題擬采用坐骨神經(jīng)縮窄性損傷模型(chronic constriction injury of sciatic nerve,CCI)為研究對象，建立tDC

6、S刺激模型，通過改變不同的刺激參數(shù)篩選tDCS治療病理性疼痛的最佳參數(shù)組合;在此基礎上，運用形態(tài)學、電生理以及行為學技術，研究PAG腦區(qū)P2X/NMDA受體在神經(jīng)病理性痛調控中的作用;通過在體行為學及離體電生理實驗，研究P2X/NMDA受體參與tDCS鎮(zhèn)痛的機制。該研究對闡明神經(jīng)病理性疼痛機制、提高tDCS鎮(zhèn)痛效率具有重要的意義。
　　方法：
　　1.建立SD大鼠神經(jīng)病理性疼痛(CCI)模型，通過Von Frey纖維絲和熱輻

7、射法檢測大鼠建模前后結扎側后肢機械痛閾和熱痛閾的變化;
　　2.通過調整電極埋置位置（同側/對側）和電流極性（正極/負極）建立四種方式的tDCS治療模型，分別檢測單次和重復運用這四種刺激方式對CCI大鼠結扎側后肢機械痛閾和熱痛閾的變化，確定最佳的刺激方式;在此基礎上，繼續(xù)檢測刺激強度、刺激時程以及介入時間點對CCI大鼠痛閾的變化，確定最佳的刺激參數(shù)組合;
　　3.通過免疫組織化學染色和免疫印跡技術，觀察經(jīng)tDCS刺激后CCI

8、大鼠初級運動皮層（primary motor cortex，M1）以及PAG腦區(qū)P2X3受體和NR2B受體表達分布以及蛋白水平變化;
　　4.全細胞膜片鉗技術觀察記錄正常大鼠PAG腦區(qū)神經(jīng)元在分別給予P2X3受體特異性激動劑α，β-亞甲基ATP(α,β-methylene-ATP，α,β-meATP)和特異性阻斷劑A-317491后神經(jīng)元興奮性的變化，觀察NMDA受體抑制劑MK-801對PAG神經(jīng)元興奮性變化的影響;觀察記錄CCI

9、大鼠在分別給予A-317491和MK-801后神經(jīng)元興奮性的變化;
　　5.制備vlPAG腦內置管后的CCI大鼠模型，注射A-317491阻斷P2X3受體功能后，在PAG微量注射ATP的類似物α，β-meATP，觀察CCI大鼠機械痛閾和熱痛閾的變化;注射MK-801阻斷NMDA受體功能后，在PAG微量注射α，β-meATP，觀察CCI大鼠機械痛閾和熱痛閾的變化;
　　6.制備vlPAG腦內置管后的tDCS大鼠模型，tDCS治

10、療結束后分別注射A-317491和MK-801，觀察CCI大鼠機械痛閾和熱痛閾的變化，明確P2X3受體和NMDA受體對rDCS鎮(zhèn)痛作用的影響。
　　結果：
　　1.成功制備CCI大鼠模型，該模型能夠較好的模擬慢性神經(jīng)病理性疼痛，觀察發(fā)現(xiàn)CCI大鼠機械痛閾及熱痛閾值較正常組大鼠降低，至術后14d達到最低值，其后痛閾值逐步恢復，痛行為逐步改善。
　　2.成功制備tDCS刺激模型，這種模型可以根據(jù)需求設置為陽極tDCS和陰極

11、tDCS。單次的陽極/陰極tDCS均可以引起CCI大鼠的機械痛閾及熱痛閾升高，同側陰極tDCS的鎮(zhèn)痛效果要優(yōu)于對側陽極tDCS，但是各組鎮(zhèn)痛效果在24h內逐步消失;重復的陽極/陰極tDCS能有效地改善CCI術后所導致的痛行為，但是改善的效果及治愈率取決于tDCS相關各項參數(shù)，刺激時間越長、刺激的強度越大，tDCS所產生的鎮(zhèn)痛作用就越好，且這種鎮(zhèn)痛作用的后效應可以維持一周以上;對側陽極對CCI大鼠鎮(zhèn)痛的效果最穩(wěn)定。tDCS對痛閾的恢復還與

12、介入時間相關，介入時間越早、介入的次數(shù)越多，CCI大鼠疼痛的恢復程度就越好。
　　3.免疫組織化學和免疫印跡的結果顯示CCI術后14d，M1以及中腦vlPAG腦區(qū)P2X3受體以及NR2B陽性分布和蛋白表達與正常大鼠相比均有增加;陽極/陰極tDCS刺激后均可以引起CCI大鼠vlPAG以及M1腦區(qū)的P2X3和NR2B受體陽性表達和蛋白表達進一步增加。CCI術后14d，M1以及vlPAG區(qū)域GluR1受體表達增加，陽極/陰極tDCS刺激

13、后這兩個區(qū)域GluR1受體的表達及蛋白總量有所減少。
　　4.全細胞膜片鉗記錄顯示α，β-meATP可使正常大鼠PAG神經(jīng)元興奮性顯著增強，應用A-317194以及MK-801，均可使神經(jīng)元興奮性顯著降低。與正常大鼠相比較，CCI大鼠PAG神經(jīng)元的興奮性明顯增強，應用A-317194和MK-801可抑制CCI大鼠PAG神經(jīng)元的興奮性。
　　5.vlPAG腦區(qū)微量注射A-317194后CCI大鼠損傷同側后肢的熱痛閾和機械性痛閾

14、均未發(fā)生明顯變化;給予α，β-meATP后CCI大鼠機械痛閾和熱痛閾明顯升高，且具有統(tǒng)計學差異，α，β-meATP的鎮(zhèn)痛效應具有劑量依賴性和時間依賴性;PAG微量注射A-317491預處理后，α，β-meATP產生的鎮(zhèn)痛效果被顯著削弱，機械痛閾和熱痛閾值與單獨使用α，β-meATP相比有所減少。
　　6.vlPAG腦區(qū)微量注射MK-801后CCI大鼠的機械痛閾和熱痛閾明顯升高，具有統(tǒng)計學差異，MK-801的鎮(zhèn)痛效應具有劑量依賴性和

15、時間依賴性;使用MK-801在PAG微量注射進行預處理后，α，β-meATP產生的鎮(zhèn)痛效果被顯著削弱，機械痛閾和熱痛閾值與單獨使用α，β-meATP相比有所減少。
　　7.vlPAG腦區(qū)微量注射MK-801和A-317491后，tDCS對CCI大鼠的鎮(zhèn)痛效果明顯下降，機械痛閾和熱痛閾值在一段時間內明顯的減低，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1.tDCS是一種有效的鎮(zhèn)痛手段，選擇合理的刺激參數(shù)可以提高的tDCS的鎮(zhèn)

16、痛效果，選擇損傷后肢對側的M1作為靶向區(qū)域進行重復多次的陽極電刺激，可以達到最佳的鎮(zhèn)痛效果。
　　2.在PAG水平，P2X3受體具有鎮(zhèn)痛作用，抑制P2X3受體可以導致CCI大鼠的痛閾值下降，P2X3受體通過促進谷氨酸NMDA受體表達增加發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。
　　3.在PAG水平，NMDA受體具有鎮(zhèn)痛和致痛兩種作用，抑制NMDA受體可以導致CCI大鼠的痛閾值明顯增高，說明NMDA受體參與了中樞傷害性信息的加工;但是抑制NMDA受體又