中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)HCN通道參與大鼠神經(jīng)病理性痛的機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)病理性痛是一種影響人類健康的頑疾,長期困擾患者并嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量,其對于健康的危害程度不亞于腫瘤。在痛覺信息傳遞過程中,中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(periaqueductal gray,PAG)是中樞下行痛覺調(diào)制系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),其中中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)(ventrolateral periaqueductal gray,vlPAG)是機(jī)體對傷害性信息進(jìn)行自身調(diào)制或整合的重要位點(diǎn),它可被發(fā)自脊髓和延髓的第二級感受傷害性刺激的神經(jīng)元激

2、活,將傷害性信息投射至更高級中樞,進(jìn)而對傷害性信息進(jìn)行處理。同時(shí),vlPAG也發(fā)出纖維加入下行調(diào)制系統(tǒng),參與對延髓和脊髓背角內(nèi)上行性傷害性信息傳遞的調(diào)控。因此,研究vlPAG腦區(qū)參與疼痛調(diào)控的作用機(jī)制,有助于了解神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和維持的機(jī)制。以往研究表明,分布在外周及脊髓背角的超極化激活-環(huán)核苷酸門控的陽離子通道(hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated catio

3、n channels,即“HCN通道”)的異?；罨鸬纳窠?jīng)元異位放電是神經(jīng)病理性痛產(chǎn)生和持續(xù)的重要因素,部分結(jié)果提示HCN通道阻斷劑可能通過抑制脊髓以上的中樞發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。vlPAG腦區(qū)可見HCN1和HCN2通道表達(dá)分布,但目前對于vlPAG腦區(qū)HCN通道參與神經(jīng)病理性痛的發(fā)病機(jī)制尚需深入探討。
　　HCN通道家族成員是上世紀(jì)90年代被克隆出,該家族由HCN1、2、3和4四個(gè)亞型組成,廣泛分布在心血管和神經(jīng)系統(tǒng),其電生理功能的多

4、樣性一直吸引著眾多研究者的目光。HCN通道最主要的特性就是通過調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞膜生物學(xué)特性影響神經(jīng)元的興奮性及突觸信息傳遞。研究表明,HCN通道是調(diào)控心血管及神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要因素,在一系列以神經(jīng)系統(tǒng)興奮性異常改變?yōu)樘攸c(diǎn)的疾病(如癲癇、腦缺血及神經(jīng)病理性痛的研究)中,均檢測到HCN通道功能發(fā)生異常改變。目前認(rèn)為HCN通道,特別是HCN2通道在炎性痛和病理性痛中表達(dá)升高,激活速度加快,促進(jìn)外周異位放電的形成;敲除HCN2基因之后能夠明顯抑制

5、異位放電及緩解疼痛癥狀,且不影響動(dòng)物的正常感覺及痛閾。這提示HCN通道異常改變在神經(jīng)病理性痛的起始及維持中發(fā)揮重要作用,同
　　時(shí)也提示cAMP信號途徑在病理性痛發(fā)生及維持中發(fā)揮很重要的作用,但迄今為止對于vlAPG區(qū)HCN通道在神經(jīng)病理性痛發(fā)病中的作用尚缺乏研究。我們推測在神經(jīng)病理性痛過程中vlPAG腦區(qū)HCN通道可能出現(xiàn)表達(dá)、功能變化,使某些類型神經(jīng)元電活動(dòng)發(fā)生改變,進(jìn)而參與或者誘導(dǎo)了病理性痛相關(guān)疾病癥狀的發(fā)生及維持。

6、　　本課題擬通過坐骨神經(jīng)CCI(chronic constriction injury)手術(shù)制備神經(jīng)病理性痛動(dòng)物模型,運(yùn)用形態(tài)學(xué)、電生理以及行為學(xué)技術(shù),研究vlPAG腦區(qū)HCN通道在神經(jīng)病理性痛調(diào)控中的作用;通過在體行為學(xué)及離體電生理實(shí)驗(yàn),研究HCN通道抑制劑參與鎮(zhèn)痛的具體分子及電生理機(jī)制;并以cAMP信號途徑為切入點(diǎn),初步探討病理性痛過程中vlPAG腦區(qū)HCN通道功能改變的調(diào)控機(jī)制,為治療神經(jīng)病理性疼痛提供深入的理論基礎(chǔ)。
　　

7、方法:
　　1.通過坐骨神經(jīng)CCI手術(shù)制備大鼠神經(jīng)病理性痛模型,并通過實(shí)時(shí)定量PCR、免疫組織化學(xué)染色和Westernblot定量觀察vlPAG腦區(qū)CCI術(shù)后HCN1和HCN2通道m(xù)RNA水平和蛋白的表達(dá)及分布改變;
　　2.制備vlPAG腦內(nèi)置管后的CCI大鼠模型,注射HCN通道阻斷劑后,通過熱輻射法和VonFrey(vFh)纖維絲檢測大鼠熱痛閾和機(jī)械性痛閾的變化;
　　3.腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察記錄正常及CCI組

8、腦組織片vlPAG腦區(qū)神經(jīng)元的HCN通道電流及神經(jīng)興奮性的變化情況。通過Biocytin標(biāo)記對腦組織片vlPAG腦區(qū)記錄細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。
　　4.應(yīng)用“胞內(nèi)cAMP檢測試劑盒”檢測正常及CCI組vlPAG腦區(qū)組織胞內(nèi)cAMP水平的差異,全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察記錄腦組織片vlPAG腦區(qū)神經(jīng)元在分別給予AC激動(dòng)劑FSK和HCN通道抑制劑后神經(jīng)元興奮性的變化。
　　結(jié)果:
　　1.成功制備了大鼠坐骨神經(jīng)CCI神經(jīng)病理性痛的

9、動(dòng)物模型,CCI術(shù)后大鼠熱痛閾和機(jī)械性痛閾均顯著降低,術(shù)后14d最明顯,假手術(shù)組大鼠痛閾未見明顯變化。CCI組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能未受影響,與假手術(shù)組和正常組大鼠相比較無顯著差異。
　　2.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示大鼠CCI術(shù)后14d,其vlPAG腦區(qū)HCN1和HCN2通道m(xù)RNA水平均顯著上調(diào);免疫組織化學(xué)和Westernblot結(jié)果顯示大鼠CCI術(shù)后14d,vlPAG腦區(qū)HCN1通道和HCN2通道蛋白表達(dá)顯著增加,神經(jīng)元胞膜表達(dá)顯著升

10、高,且陽性神經(jīng)元比例顯著升高。
　　3.vlPAG腦區(qū)微量注射生理鹽水后CCI大鼠的熱痛閾和機(jī)械性痛閾均未發(fā)生明顯變化;給予ZD7288后的CCI大鼠其損傷同側(cè)后肢熱痛閾和機(jī)械性痛閾明顯升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,HCN通道阻斷劑ZD7288的鎮(zhèn)痛效應(yīng)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性,劑量越高效果越明顯,且效果雖注射后時(shí)間迅速升高,而后逐漸降低。vlPAG腦區(qū)注射生理鹽水或ZD7288對正常及模型動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能無顯著影響。
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11、.全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示vlPAG腦區(qū)一類神經(jīng)元具有HCN通道電流特性。與假手術(shù)對照組相比較,CCI組大鼠術(shù)后14dvlPAG腦區(qū)神經(jīng)元HCN電流顯著增強(qiáng),激活曲線向去極化偏移,神經(jīng)元興奮性增加。應(yīng)用ZD7288阻斷HCN通道后,神經(jīng)元興奮性顯著降低。Biocytin標(biāo)記顯示所記錄細(xì)胞位于vlPAG腦區(qū)。
　　5.胞內(nèi)cAMP檢測結(jié)果顯示CCI組的vlPAG腦區(qū)cAMP水平顯著高于假手術(shù)對照組。全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示正常大鼠腦組織孵育

12、AC激動(dòng)劑后升高胞內(nèi)cAMP水平后vlPAG腦區(qū)神經(jīng)元興奮性顯著增強(qiáng),同時(shí)應(yīng)用HCN通道阻斷劑ZD7288后,神經(jīng)元興奮性回落至接近正常水平。
　　結(jié)論:
　　1.神經(jīng)病理性痛大鼠vlPAG腦區(qū)HCN1和HCN2通道表達(dá)水平發(fā)生改變,與神經(jīng)病理性痛的發(fā)生及維持相關(guān)。
　　2.神經(jīng)病理性痛大鼠vlPAG腦區(qū)Ih電流增強(qiáng)后參與調(diào)控神經(jīng)元興奮性改變,進(jìn)而參與神經(jīng)病理性痛的維持。
　　3.神經(jīng)病理性痛發(fā)病過程中cAMP信