人臍帶膠質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與特性研究.pdf

1、細(xì)胞治療已經(jīng)走過十多年的歷程，起初科學(xué)家對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行大量研究，如細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）治療癌癥具有可觀的前景；而目前科學(xué)界對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）的研究較為關(guān)注，由于hUC-MSC比胚胎干細(xì)胞（ESC）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）等具有更好的臨床應(yīng)用潛能，從而成為人類再生醫(yī)學(xué)和組織工程的研究熱點(diǎn)。
　　本研究目的是

2、探索更有效的hUC-MSC分離培養(yǎng)方法和進(jìn)一步研究hUC-MSC生物學(xué)特性，通過建立優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法，能為再生醫(yī)學(xué)科研和臨床應(yīng)用提供操作規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)和參考依據(jù)。方法：實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取足月順產(chǎn)健康胎兒臍帶，采取手工機(jī)械分離法和3種酶組合消化法從臍帶膠質(zhì)中釋放人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞；并用優(yōu)化完全培養(yǎng)基純化培養(yǎng)；MTT法檢測(cè)各代臍帶間充質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性并繪制生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)臍其生長(zhǎng)周期和表面標(biāo)志物；RT-PCR擴(kuò)增基因P53、C-myc和OCT-4

3、；結(jié)果：培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)為梭形、呈纖維樣，并出現(xiàn)流水狀或漩渦樣生長(zhǎng)；生長(zhǎng)增殖速度較快，第7代臍帶間充質(zhì)細(xì)胞指數(shù)倍增時(shí)間小于30h；80％以上細(xì)胞處于G0/G1期；培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)細(xì)胞均一穩(wěn)定高表達(dá)CD29、CD70、CD105、CD90和CD44，而幾乎不表達(dá)CD45、CD34和HLA-DR；P53基因在各代臍帶間充質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，C-myc基因在第4代和第18代出現(xiàn)明顯表達(dá)，OCT-4基因在不同代數(shù)均出現(xiàn)表達(dá)；結(jié)論：1）1h可分離

4、30cm臍帶膠質(zhì)，獲得的大量臍帶間充質(zhì)細(xì)胞（9?104/cm），經(jīng)培養(yǎng)檢測(cè)證明具有hUC-MSC的形態(tài)特征、增殖活性，表面抗原一致，是原始的hUC-MSC；2）通過RT-PCR檢測(cè)各代臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的P53、C-myc和OCT-4基因，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)10代以內(nèi)hUC-MSC狀態(tài)較正常。本研究意義：提示在臨床應(yīng)用hUC-MSC時(shí)，對(duì)其癌基因和抑癌基因全面檢測(cè)以及衰老凋亡系統(tǒng)檢測(cè)很有必要；本實(shí)驗(yàn)可為短期培養(yǎng)擴(kuò)增出臨床治療所需要安全可靠的MSC提供