喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、隨著喉微創(chuàng)技術(shù)的應(yīng)用及普及，目前可以在顯微鏡下借助激光等手段切除聲帶早期病變，但病變切除的同時(shí)，若造成了聲帶固有層的缺失，術(shù)后疤痕形成，就會(huì)影響患者的發(fā)音。聲帶疤痕已成為我們迫切需要改善并解決的一個(gè)重要問(wèn)題。干細(xì)胞注射作為治療聲帶疤痕的一種新的治療手段，為我們帶來(lái)了希望。人們嘗試?yán)霉撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞、肌源性干細(xì)胞及脂肪基質(zhì)干細(xì)胞等不同的成體干細(xì)胞來(lái)治療聲帶疤痕，但是因?yàn)閼?yīng)用以上的干細(xì)胞存在著取材困難，細(xì)胞植入后形成的組織結(jié)構(gòu)差異大等缺點(diǎn)

2、，因此，目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)理想的，令人滿意的干細(xì)胞治療手段。
　　近年來(lái)隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在成熟的高等動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在著間充質(zhì)干細(xì)胞，而且它們還參與了不同組織的形成與發(fā)展。因此，本研究的目的是為了確定聲帶固有層和會(huì)厭黏膜固有層中是否均存在著間充質(zhì)干細(xì)胞，并且通過(guò)MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法比較聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞和會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，尋找一種能夠用于聲帶組織工程修復(fù)的理想的間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　1.目的：<

3、br>　　探討聲帶固有層和會(huì)厭黏膜固有層中是否存在間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymalstemcells,MSC)，并對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，比較其生物學(xué)特性，為喉部組織的創(chuàng)傷修復(fù)提供新的細(xì)胞來(lái)源。
　　2.方法：
　　2.1.喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞（Laryngealmucosamesenchymalstemcells，LM-MSC）的分離培養(yǎng)及鑒定
　　2.1.1.聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Vocalfoldmesenchym

4、alstemcells,VF-MSC)的分離培養(yǎng)及鑒定：
　　從喉癌手術(shù)患者術(shù)中切下的組織中獲取正常聲帶固有層，利用組織塊培養(yǎng)法獲得固有層來(lái)源的細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行表面標(biāo)志物的分析，及利用成脂、成骨誘導(dǎo)液對(duì)其進(jìn)行多項(xiàng)分化能力的研究。
　　2.1.2.會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Epiglottismucosamesenchymalstemcells,EP-MSC)的分離培養(yǎng)及鑒定：
　　從喉癌手術(shù)患者術(shù)中切下的組織中

5、獲取正常會(huì)厭舌面黏膜，利用消化培養(yǎng)法獲得固有層來(lái)源的細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行表面標(biāo)志物的分析，及利用成脂、成骨、成神經(jīng)誘導(dǎo)液對(duì)其進(jìn)行多項(xiàng)分化能力的研究。
　　2.2.聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞與會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性比較
　　繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較hVF-MSC和hEP-MSC的生長(zhǎng)增殖情況，采用平板克隆形成試驗(yàn)，比較其克隆形成能力。取第4代正常的hVF-MSC和hEP-MSC貼壁培養(yǎng)后加入含有VitC的膜片培養(yǎng)液，培養(yǎng)2

6、w后用顯微鑷將膜片撕下，置于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)至膜片縮成團(tuán)狀。將細(xì)胞團(tuán)移植于裸鼠皮下2w后取材，取材后行H&E和免疫組化Vimentin染色，觀察細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的存活及生長(zhǎng)情況。
　　2.3.炎癥微環(huán)境對(duì)會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的影響
　　通過(guò)在培養(yǎng)液中加入IL-1β和TNF-α來(lái)模擬炎癥微環(huán)境。細(xì)胞被分為兩組，一組是加入炎癥因子的炎癥組，另一組是使用正常培養(yǎng)液的對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容包括：①M(fèi)TT試驗(yàn)觀察急性炎癥對(duì)細(xì)胞增殖的影響

7、。②流式細(xì)胞儀測(cè)定誘導(dǎo)7天炎癥微環(huán)境對(duì)細(xì)胞凋亡和周期的影響。③實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定炎癥微環(huán)境對(duì)膠原相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　3.結(jié)果：
　　3.1.喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　3.1.1.聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：
　　原代培養(yǎng)3d左右，細(xì)胞開(kāi)始貼壁，成短梭形，貼壁24h細(xì)胞伸展成長(zhǎng)梭形，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，但是胞突的形態(tài)更加細(xì)長(zhǎng)，核較大，呈橢圓形。利用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行表面標(biāo)志物的分析，hVF

8、-MSC高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志(CD29-57.3％、CD44-99.1％、CD90-97％、CD105-26％、CD146-4.8％)，不表達(dá)造血系(CD34-0.9％、CD45-0.4％)的表面標(biāo)志。在體外分別經(jīng)成脂、成骨誘導(dǎo)分化后，油紅O染色陽(yáng)性，茜素紅染色陽(yáng)性。
　　3.1.2.會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：
　　原代培養(yǎng)3d左右，細(xì)胞開(kāi)始貼壁，成短梭形，貼壁24h后細(xì)胞伸展成長(zhǎng)梭形，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞

9、，核較大，呈橢圓形。利用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行表面標(biāo)志物的分析，hEP-MSC高表達(dá)間充質(zhì)的表面標(biāo)志(CD29-16.9％、CD44-97.4％、CD90-89.5％、CD105-85.9％、CD146-2.5％、stro-1-20.4％)，不表達(dá)造血系(CD34-1.2％、CD45-0.8％)的表面標(biāo)志。在體外分別經(jīng)成脂、成骨和成神經(jīng)誘導(dǎo)分化后，油紅O染色陽(yáng)性，茜素紅染色陽(yáng)性，神經(jīng)細(xì)胞特異性抗原S100呈陽(yáng)性表達(dá)。
　　3.2.聲帶

10、間充質(zhì)干細(xì)胞與會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性比較
　　繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（MTT）可以觀察到在4至7天hVF-MSC較hEP-MSC有較快的生長(zhǎng)增殖速度（P<0.05）。通過(guò)平板克隆形成試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)hVF-MSC較hEP-MSC具有更高的克隆形成能力（P<0.05），兩者均可以形成不同形態(tài)和大小的克隆。hVF-MSC和hEP-MSC均可成功的培養(yǎng)出膜片，裸鼠背部正中皮下體內(nèi)移植2w后取材。H&E染色的結(jié)果顯示細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)良好且無(wú)

11、炎癥反應(yīng)，免疫組化Vimentin染色的結(jié)果可以觀察到細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況，細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)清晰兩者沒(méi)有明顯的差異。
　　3.3.炎癥微環(huán)境對(duì)會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的影響
　　MTT實(shí)驗(yàn)觀察急性炎癥對(duì)hEP-MSC生長(zhǎng)增殖能力的影響。利用吸光值繪制生長(zhǎng)曲線，比較hEP-MSC在炎癥和正常條件下培養(yǎng)5d細(xì)胞的增殖能力。炎癥組與正常組相比，增殖明顯加快(p<0.05)。但誘導(dǎo)7天的細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，炎癥組G0G1(69.55％)期較

12、高，而S(29.0％)和G2M(1.45％)較對(duì)照組(S=29.4％,G2M=7.52％,G0G1=63.08％)低。炎癥7天可使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，降低S和G2/M期細(xì)胞比例，提示炎癥7天已經(jīng)開(kāi)始抑制細(xì)胞的增殖，阻滯了細(xì)胞周期進(jìn)程，影響了其復(fù)制。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)7天的結(jié)果顯示，炎癥組（2.5％）比正常組（1.7％）的凋亡比例更高。對(duì)炎癥誘導(dǎo)的hEP-MSC在4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（6h，12h，24h，48h）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定，CO

13、L-1的表達(dá)量均下降，COL-3的表達(dá)量在24h內(nèi)下降，48h明顯上升。MMP-1的表達(dá)量在所有的時(shí)間點(diǎn)均上升（P<0.05）。
　　4.結(jié)論：
　　4.1.本實(shí)驗(yàn)利用組織塊培養(yǎng)法成功地培養(yǎng)鑒定了聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并證明了其具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的能力。利用消化培養(yǎng)法成功地培養(yǎng)鑒定了會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞，并證明了其具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。
　　4.2.聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞較會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞有

14、較快的生長(zhǎng)增殖速度和較好的克隆形成能力。兩種細(xì)胞膜片裸鼠體內(nèi)移植的結(jié)果初步顯示，hVF-MSC和hEP-MSC均可用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，且細(xì)胞可以在體內(nèi)正常生長(zhǎng)，為hEP-MSC應(yīng)用于大型動(dòng)物的體內(nèi)試驗(yàn)提供了良好的證據(jù)。
　　4.3.炎癥因子誘導(dǎo)早期，hEP-MSC的生長(zhǎng)增殖能力與對(duì)照組相比明顯加快。誘導(dǎo)7天后，細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示炎癥可以導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡明顯增加，細(xì)胞周期的結(jié)果顯示炎癥可以導(dǎo)致細(xì)胞處于增殖期的數(shù)量減少。通過(guò)對(duì)炎癥誘導(dǎo)的hEP-