平邑甜茶IPT3基因的克隆及其對氮信號響應特性.pdf

1、在已研究不同形態(tài)氮養(yǎng)分對果樹葉片生長影響的基礎上，為探討果樹葉片生長對根際硝態(tài)氮產生較快反應的機理，以水培平邑甜茶幼苗為試材，克隆根系細胞分裂素合成酶(異戊烯基轉移酶)編碼基因(MhIPT3)，同時采用實時熒光定量PCR研究MhIPT3表達量的變化，采用酶聯免疫測定植株中Z+ZR與iP+iPA、IAA、ABA含量的改變，并測定分析了不同供氮形態(tài)對植株生長的影響，主要結果如下： 1.根據已知蘋果異戊烯基轉移酶基因的EST序列，設計

2、特異引物利用RT-PCR結合RACE技術獲得了異戊烯基轉移酶基因，命名為MhIPT3。GenBank注冊號為DQ792508。序列分析表明，MhIPT3 cDNA全長1314 bp，含有963 bp的完整開放閱讀框，編碼分子量為37.3 KD的321個氨基酸；結構分析發(fā)現，MhIPT3蛋白上含有ATP/ADP結合位點；同源性分析發(fā)現，MhlPT3蛋白與AtPTl，AtIPT3，AtIPT4，AtIPT5，AtIPT6，AtIPT7和At

3、IPT8蛋白同源性分別為34.22％，53.27％，35.34％，55.29％，35.11％，47.43％和38.14％，而與AtIPT2和AtIPT9氨基酸同源性僅為25.1％和25.52％；聚類分析表明，MhIPT3蛋白與LjIPT3(Lotus japonicus)、AtIPT3 (Arabidopsis thaliana)和BrIPT3(Brassica rapa L.)蛋白的同源性最高。以平邑甜茶的DNA為模板進行MhIPT3

4、編碼區(qū)的克隆，結果發(fā)現所克隆的序列與以cDNA為模板所克隆的編碼區(qū)序列完全相同，說明MhIPT3編碼區(qū)內沒有內含子。構建了pBI121-MhIPT3正反義表達載體，并對煙草和‘皇家嘎拉’蘋果進行農桿菌侵染的遺傳轉化。將MhIPT3編碼區(qū)正向克隆到原核表達載體pET30a-c(+)，并通過原核表達獲得了MhIPT3蛋白，為進一步研究異戊烯基轉移酶的功能提供了條件。 2.熒光定量PCR分析MhIPT3的表達發(fā)現，MhIPT3基因在平

5、邑甜茶的根、莖、葉中均有表達且在葉中的表達量最高。對N饑餓的平邑甜茶施用NO3-0.5 h后MhIPT3的表達量開始增加，2 h后達到最大，但NH4+處理對MhIPT3的表達沒有影響；根中iP+iPA和Z+ZR與MhIPT3表達量呈現相似的變化趨勢。處理24 h，NO3-處理與NH4+處理IAA含量差異不顯著，ABA含量NO3處理高于NH4+處理：到第72 h與168 h，IAA含量差異仍然不顯著，ABA含量NO3-處理低于NH4+處理