平邑甜茶SnRK1基因的克隆、表達及其功能的研究.pdf

1、模式植物研究發(fā)現(xiàn)蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶-1在植物碳氮代謝過程中有關(guān)鍵性開關(guān)的作用，為探討SnRK1(蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶-1)在果樹碳氮代謝中的分子生物學(xué)功能，以水培平邑甜茶幼苗為試材，克隆蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶-1的α和βγ亞基的編碼基因，同時采用實時熒光定量PCR研究α和βγ亞基的編碼基因表達量的變化，并構(gòu)建α亞基的編碼基因MhSnRK1的正、反以表達載體，成功轉(zhuǎn)化番茄，初步研究了其生理生化功能，主要結(jié)果如

2、下： 1.根據(jù)已知蘋果SnRK1的α亞基編碼基因的EST序列，設(shè)計特異引物利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)獲得了蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶-1的α亞基的全長編碼基因，命名為MhSnRK1，GenBank注冊號為EF690362;并利用相同技術(shù)擴增到平邑甜茶SnRK1的βγ亞基編碼基因的片段，命名為MhAKINβγ。序列分析表明，MhSnRK1基因全長2063 bp，包含一個166 bp的5’端非編碼區(qū)，1548 bp的編碼區(qū)

3、共編碼515個氨基酸和348 bp的3’端非編碼區(qū)，預(yù)測分子量為58.7 KD。同時MhSnRK1的氨基酸序列分析顯示該基因與擬南芥、黃瓜、番茄和煙草相比有82％-88％的同源性；系統(tǒng)進化樹分析顯示，MhSnRK1基因與黃瓜α亞基編碼基因(SnRK1)基因的同源關(guān)系最近。βγ亞基的片段(MhAKINβγ)與已知蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶-1 AKINβγ亞基編碼基因具有較高同源性，故進一步確定其為平邑甜茶蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激

4、酶-1的AKINβγ亞基編碼基因片段。 2.熒光定量PCR分析α和βγ亞基的編碼基因在不同組織的表達發(fā)現(xiàn)，MhSnRK1和MhAKINβγ基因在平邑甜茶的根、莖、葉中均有表達，且均在葉中的表達量最大。本文對這兩個亞基的編碼基因在不同環(huán)境條件下在不同組織中的表達特性的研究結(jié)果顯示：硝態(tài)氮處理抑制了MhSnRK1基因在葉、根中的表達：在PEG處理下，MhSnRK1的表達水平在根中先上升(24小時)，但48小時后又恢復(fù)到初始狀態(tài)：葉片

5、中，MhSnRK1的表達初期下降而48小時后又上升到初始態(tài)；在硝態(tài)氮和PEG處理下，MhAKINβγ表現(xiàn)出與MhSnRK1相似的表達特性。外施硝態(tài)氮，根中MhAKINβγ轉(zhuǎn)錄水平24小時內(nèi)降低3倍，48小時后葉中也較低：在PEG處理下，MhAKINβγ的表達水平在根中先上升；葉片中，MhAKINβγ的表達初期下降10倍而48小時后又上升到初始態(tài)。 3.為進一步研究平邑甜茶SnRK1的生理生化功能，將蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶

6、-1的α亞基的全長編碼基因，構(gòu)建了pBI121- MhSnRK1正、反義表達載體，并對番茄進行農(nóng)桿菌侵染的遺傳轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)基因番茄果實內(nèi)含物進行測定后初步發(fā)現(xiàn)：與對照相比，正義轉(zhuǎn)基因番茄果實中可溶性總糖和淀粉含量最大升高分別30％和56％;而正義轉(zhuǎn)基因番茄果實中有機酸和可溶性蛋白含量最大分別下降88％和76％。轉(zhuǎn)基因植株果實發(fā)育期比野生型提早10天；果實直徑在發(fā)育早期明顯大于野生型。本研究測定了轉(zhuǎn)基因株系和野生型葉片中淀粉含量的日變化，白