平邑甜茶GLB1基因的克隆、表達(dá)及其功能的研究.pdf

1、模式植物研究發(fā)現(xiàn)GLB1編碼非共生血紅蛋白，該蛋白的主要功能包括以下幾個方面：（1）因?yàn)楹脱醯挠H和力強(qiáng)，所以可能起到清除氧的作用。（2）通過與黃素蛋白（類似于細(xì)菌和酵母體內(nèi)的黃素血紅蛋白）的相互作用用參與電子傳遞。（3）、結(jié)合一些已知的配體（O2，NO和CO），作為感受機(jī)制的一部分，比如針對配體水平的波動而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝。（4）與有機(jī)小分子結(jié)合，在脂肪酸的運(yùn)輸中起作用或者參與低氧條件下的有機(jī)物的合成。為探討GLB1在果樹抵抗非生物脅迫

2、中的分子生物學(xué)功能，以水培平邑甜茶實(shí)生苗為試材，克隆了非共生血紅蛋白-1的編碼基因，同時采用實(shí)時熒光定量PCR研究了MhGLB1基因在NO3-、SNP、低氧脅迫及ABA處理下表達(dá)量的變化，并構(gòu)建了MhGLB1的正義表達(dá)載體，成功轉(zhuǎn)化了番茄，初步研究了其生理生化功能，主要結(jié)果如下：
　　 1.根據(jù)已知蘋果GLB1基因的EST序列，設(shè)計特異引物利用PCR技術(shù)獲得非共生血紅蛋白-1的全長編碼區(qū)，命名為MhGLB1，GenBank注冊號

3、為GQ423619。序列分析表明，MhGLB1基因編碼區(qū)477bp，共編碼158個氨基酸，預(yù)測分子量為17.8kDa。同時MhGLBl的氨基酸序列分析顯示該基因與梨（Pyrus communis）、棉花（Gossypium hirsutum）、苜蓿（Medicagosativa）的非共生血紅蛋白的同源性分別為95.57％、82.82％、80.12％；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，MhGLB1基因與梨的同源關(guān)系最近。故進(jìn)一步確定其為平邑甜茶非共生血

4、紅蛋白-1的編碼基因。
　　 2.熒光定量PCR分析MhGLB1基因在不同組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MhGLB1在平邑甜茶的根、莖、葉中均有表達(dá)，且在根中的表達(dá)量最大。對MhGLB1基因在不同環(huán)境條件下在不同組織中的表達(dá)特性的研究結(jié)果顯示：硝態(tài)氮處理增加了MhGLB1在根、莖、葉中的表達(dá)，且在根中MhGLB1的含量2h時就明顯升高，莖和葉中MhGLB1的表達(dá)量是緩慢增加的；在SNP處理下，MhGLB1的表達(dá)量2h時已迅速增加，4h時表達(dá)

5、量比峰值下降50.8％，但仍高于對照，之后又有所增加；ABA處理4h能夠使MhGLB1的含量顯著高于對照，用c-PTIO預(yù)處理后再用ABA處理時，MhGLB1的含量與對照差異不顯著。
　　 3.為進(jìn)一步研究平邑甜茶GLB1的生理生化功能，將非共生血紅蛋白-1的編碼基因，構(gòu)建了pBI121-MhGLB1正義表達(dá)載體，并對番茄進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染的遺傳轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)基因番茄的抗?jié)承赃M(jìn)行了初步檢測發(fā)現(xiàn)：與野生型植株（WT）相比，轉(zhuǎn)基因番茄（1號