平邑甜茶GLB1基因的克隆、表達及其功能的研究.pdf

1、模式植物研究發(fā)現(xiàn)GLB1編碼非共生血紅蛋白，該蛋白的主要功能包括以下幾個方面：（1）因為和氧的親和力強，所以可能起到清除氧的作用。（2）通過與黃素蛋白（類似于細菌和酵母體內的黃素血紅蛋白）的相互作用用參與電子傳遞。（3）、結合一些已知的配體（O2，NO和CO），作為感受機制的一部分，比如針對配體水平的波動而調節(jié)細胞內的代謝。（4）與有機小分子結合，在脂肪酸的運輸中起作用或者參與低氧條件下的有機物的合成。為探討GLB1在果樹抵抗非生物脅迫

2、中的分子生物學功能，以水培平邑甜茶實生苗為試材，克隆了非共生血紅蛋白-1的編碼基因，同時采用實時熒光定量PCR研究了MhGLB1基因在NO3-、SNP、低氧脅迫及ABA處理下表達量的變化，并構建了MhGLB1的正義表達載體，成功轉化了番茄，初步研究了其生理生化功能，主要結果如下：
　　 1.根據(jù)已知蘋果GLB1基因的EST序列，設計特異引物利用PCR技術獲得非共生血紅蛋白-1的全長編碼區(qū)，命名為MhGLB1，GenBank注冊號

3、為GQ423619。序列分析表明，MhGLB1基因編碼區(qū)477bp，共編碼158個氨基酸，預測分子量為17.8kDa。同時MhGLBl的氨基酸序列分析顯示該基因與梨（Pyrus communis）、棉花（Gossypium hirsutum）、苜蓿（Medicagosativa）的非共生血紅蛋白的同源性分別為95.57％、82.82％、80.12％；系統(tǒng)進化樹分析顯示，MhGLB1基因與梨的同源關系最近。故進一步確定其為平邑甜茶非共生血

4、紅蛋白-1的編碼基因。
　　 2.熒光定量PCR分析MhGLB1基因在不同組織中的表達發(fā)現(xiàn)，MhGLB1在平邑甜茶的根、莖、葉中均有表達，且在根中的表達量最大。對MhGLB1基因在不同環(huán)境條件下在不同組織中的表達特性的研究結果顯示：硝態(tài)氮處理增加了MhGLB1在根、莖、葉中的表達，且在根中MhGLB1的含量2h時就明顯升高，莖和葉中MhGLB1的表達量是緩慢增加的；在SNP處理下，MhGLB1的表達量2h時已迅速增加，4h時表達

5、量比峰值下降50.8％，但仍高于對照，之后又有所增加；ABA處理4h能夠使MhGLB1的含量顯著高于對照，用c-PTIO預處理后再用ABA處理時，MhGLB1的含量與對照差異不顯著。
　　 3.為進一步研究平邑甜茶GLB1的生理生化功能，將非共生血紅蛋白-1的編碼基因，構建了pBI121-MhGLB1正義表達載體，并對番茄進行農桿菌侵染的遺傳轉化。對轉基因番茄的抗?jié)承赃M行了初步檢測發(fā)現(xiàn)：與野生型植株（WT）相比，轉基因番茄（1號