HBV宮內感染與免疫阻斷失敗的相關性研究.pdf

1、目的:
　　 分析沈陽地區(qū)孕婦血清的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)標志物及HBVDNA，調查沈陽地區(qū)孕婦慢性HBV感染的血清學及病毒學特點;高病毒載量的HBV體外感染人胎盤絨毛膜癌BeWo細胞，探討HBV宮內感染機制;應用乙型肝炎人免疫球蛋白(human hepatitis B immunoglobulin，HBIG)阻斷HBV體外感染人胎盤絨毛膜癌BeWo細胞的實驗研究，為HBIG阻斷HBV宮內感染

2、提供理論依據(jù):構建早期胎盤屏障和晚期胎盤屏障，比較HBV穿透早期胎盤屏障和晚期胎盤屏障的能力及研究HBIG阻斷HBV穿透早期胎盤能力，提出阻斷HBV宮內感染的新策略。
　　 材料與方法:
　　 一、臨床部分:
　　 1.研究對象:
　　 選擇2010年6月-2011年11月在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院產科病房分娩的沈陽地區(qū)的孕婦為研究對象。所有的孕婦完善乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis Bs ant

3、igen，HBsAg)檢測，對于血清HBsAg陽性的孕婦建立檔案，留取血清，-20℃凍存。
　　 2.主要試劑:
　　 (1) HBsAg、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)定量檢測試劑盒:雅培，美國。
　　 (2) HBVDNA定量檢測試劑盒:羅氏，美國。
　　 3.實驗方法:
　　 (1) HBsAg陽性的孕婦血清HBeAg檢測:化學發(fā)光微粒子免疫法。

4、
　　 (2) HBsAg陽性的孕婦血清HBVDNA檢測:實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)。
　　 4.統(tǒng)計學分析:
　　 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。組間率的比較應用Fisher's精確概率法進行統(tǒng)計分析，并計算比值比(odd ratio，OR)和95％可信區(qū)間(confidenceinterval，CI)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

5、
　　 二、體外實驗:
　　 1.研究對象:
　　 人胎盤絨毛膜癌BeWo細胞。BeWo細胞及其F-12K細胞培養(yǎng)液購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）。當細胞培養(yǎng)處于對數(shù)生長期進行實驗研究。
　　 2.主要試劑:
　　 (1)血清/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒:北京天根生化科技有限公司。
　　 (2) HBVDNA檢測

6、試劑盒:深圳凱杰生物工程有限公司。
　　 (3) HBsAg定量檢測試劑盒:雅培，美國。
　　 (4)鼠抗人HBsAg單克隆抗體:北京中杉金橋生物技術公司。
　　 (5)兔抗人乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B cantigen，HBcAg)多克隆抗體:北京中杉金橋生物技術公司。
　　 (6)即用型鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(streptavidin-biotin-enzymecomp

7、lex，SABC)免疫組化染色試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司。
　　 (7) HBIG:華蘭生物工程股份有限公司。
　　 (8) Forskolin(腺苷酸環(huán)化酶激活劑):碧云天生物技術研究所。
　　 (9)總β亞單位hCG測定試劑盒:貝克曼庫爾特商貿有限公司，美國。
　　 (10)小鼠抗人上皮性鈣粘附蛋白單克隆抗體(Mouse anti-E-Cadherin IgG):BD生命科學公司，美國。

8、>　　 (11)異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記山羊抗小鼠IgG:北京中杉金橋生物技術公司。
　　 (12)凱基細胞凋亡4，6-二氨基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色試劑盒:凱基生物技術公司。
　　 3.實驗方法:
　　 (1) HBV感染BeWo細胞后初代細胞不同時間點和各代細胞內和上清液中HBVDN

9、A檢測:實時熒光定量PCR。
　　 (2) HBV感染BeWo細胞后初代細胞不同時間點和各代細胞96 h上清液中HBsAg檢測:化學發(fā)光微粒子免疫法。
　　 (3) HBsAg和HBcAg在BeWo細胞內的表達:SABC細胞免疫組織化學染色方法。
　　 (4)應用Forskolin誘導BeWo細胞融合:上清液中人絨毛膜促性腺激素(humanchorionic gonadotrophin，hCG)檢測、細胞膜和細胞

10、核免疫熒光染色方法。
　　 (5)胎盤屏障建立:BeWo細胞在Transwell(R)細胞培養(yǎng)插入皿的內室培養(yǎng)，Millicell(R)-ERS細胞電阻儀每日測量跨上皮細胞電阻值(transepithelium electricalresistance，TEER)。測量TEER＞100Ω·cm2，即在Transwell(R)細胞培養(yǎng)插入皿的內室中BeWo細胞形成極化、緊密連接的單層細胞，模擬胎盤屏障建立
　　 (6) T

11、ranswell(R)細胞培養(yǎng)插入皿外室的HBVDNA檢測:實時熒光定量PCR。
　　 4.統(tǒng)計學分析:
　　 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。HBIG阻斷實驗中的HBVDNA結果取對數(shù)做統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗和最小顯著差異(least significant difference，LSD)法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　

12、　 一、臨床部分
　　 1.在4536例孕婦中，HBsAg攜帶率是5.49％(249/4536)。年齡≤20歲孕婦的HBsAg攜帶率是1.30％(2/154);年齡＞20歲孕婦的HBsAg攜帶率是5.64％(247/4382)。年齡＞20歲孕婦的HBsAg攜帶率是年齡≤20歲孕婦的HBsAg攜帶率的4.5倍。
　　 2.在249例HBsAg陽性的孕婦中，HBeAg陽性和HBVDNA陽性的孕婦占多數(shù)。其中HBeAg陽性是

13、167例(67.07％)，HBeAg陰性是82例(32.93％); HBVDNA陽性是204例(81.93％)，HBVDNA陰性是45例(18.07％)。
　　 3.204例HBVDNA陽性的孕婦根據(jù)其病毒載量分為3組:低病毒載量組(12IU/ml～50 IU/ml)是11例(4.42％)、中病毒載量組(50 IU/ml～107 IU/ml)是156例(62.65％)、高病毒載量組(HBVDNA≥107 IU/ml)是37例(1

14、4.86％)。高病毒載量的孕婦均是HBeAg陽性，HBVDNA陰性的孕婦均是HBeAg陰性。
　　 4.在167例HBeAg和HBVDNA均陽性的孕婦中HBVDNA范圍在1.48×101IU/ml～5.62×109 IU/ml，HBVDNA中位數(shù)是1.46×108 IU/ml;在37例HBeAg陰性而HBVDNA陽性的孕婦中HBVDNA范圍在1.97×101 IU/ml～1.63×106 IU/ml，HBVDNA中位數(shù)是7.67

15、×104 IU/ml。
　　 二、體外實驗:
　　 1.消化后BeWo細胞于37℃、5％CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長情況:BeWo細胞4h貼壁，24h生長良好、72 h～120 h形成細胞單層。
　　 2.HBV感染BeWo細胞初代各時間點細胞內和上清液中HBVDNA均隨時間延長而增加，120h達到高峰;HBV感染BeWo細胞后每96h傳代一次，各代細胞內及上清液中HBVDNA均隨著傳代

16、次數(shù)增加逐漸降低，至第5代時消失。
　　 3.HBV感染BeWo細胞初代各時間點細胞的上清液中HBsAg定量隨時間延長而增加;感染后1～3代細胞上清液中可以檢測到HBsAg，HBsAg定量隨代數(shù)增加而降低，第4代以后陰性。
　　 4.在1～3代HBV感染BeWo細胞可見HBsAg染色陽性細胞，其胞漿染成彌漫性棕黃色;1～3代HBV感染BeWo細胞可見HBcAg染色陽性細胞，其胞核可見染成棕紅色，陰性對照二者染色均陰性。<

17、br>　　 5.HBIG阻斷HBV感染BeWo細胞的實驗中:PBS清洗前，A組細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg定量檢測為陽性，B、C組細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg定量檢測均為陰性。A、B、C組細胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA定量為陽性，組間差異不明顯(P＞0.05)。經PBS清洗8次后，各組細胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA和HBsAg定量均陰性。PBS清洗后24 h～120 h，A組細胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA和HBsAg定量均陽性，且隨著時間的延長

18、而逐漸增加;PBS清洗后24 h～72 h，B、C組細胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA和HBsAg定量均陰性;PBS清洗后96 h～120 h，B、C組細胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA和HBsAg定量均陽性。PBS清洗后120 h時，A組HBVDNA和HBsAg定量分別與B、C組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而B、C組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;PBS清洗后120 h，A、B、C組細胞內HBVDNA均是陽性，分別為5.8

19、9±0.50 lg copies/ml、3.14±0.02 lg copies/ml和3.59±0.24 lgcopies/ml。
　　 6.Forskolin誘導BeWo細胞融合48 h和72 h時，細胞培養(yǎng)上清液中hCG明顯升高，免疫熒光染色可見細胞發(fā)生融合，成功模擬早期胎盤和晚期胎盤。
　　 7.BeWo細胞在Transwell(R)細胞培養(yǎng)插入皿中培養(yǎng)72 h可以形成極化、緊密連接的單層細胞，模擬胎盤屏障已建立。

20、
　　 8.HBV穿透早期胎盤屏障多于晚期胎盤屏障，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 9.HBIG能夠減少HBV穿透早期胎盤屏障，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.沈陽地區(qū)年齡≤20歲孕婦HBsAg攜帶率較年齡＞20歲孕婦HBsAg攜帶率有明顯的降低，這可能是與沈陽地區(qū)自從1988年開始對新生兒乙型肝炎疫苗的普遍免疫預防接種有關;HBsAg陽性孕婦中HBeAg陽性

21、和HBVDNA陽性孕婦占較高的比例，因此在妊娠期間篩查HBsAg是必要的;高病毒載量的慢性HBV感染的孕婦所占的比例不高，因此不必要所有HBsAg陽性的孕婦均抗病毒治療。
　　 2.HBV可以體外感染BeWo細胞，且能在傳代細胞中表達。BeWo細胞可用于進行HBV宮內感染機制的研究。
　　 3.體外實驗證實HBIG具有中和HBV及阻斷HBV對BeWo細胞感染的作用。妊娠期注射HBIG可能降低HBV的宮內感染機率。