HBV感染引起的肝癌中HBV cccDNA與APOBEC3的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒持續(xù)感染的關(guān)鍵因子，為了研究肝癌發(fā)生過(guò)程中宿主對(duì)病毒cccDNA的調(diào)控，我們檢測(cè)了HCC樣本中配對(duì)的癌組織和癌旁組織中HBV cccDNA的表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析了宿主抗病毒因子APOBEC家族基因與HBV cccDNA的相關(guān)性。
　　方法：首先通過(guò)特異性熒光定量PCR方法檢測(cè)了49例配對(duì)的癌組織及癌旁組織中肝臟

2、內(nèi)HBV cccDNA和HBV total DNA的表達(dá)水平，并用配對(duì)秩和檢驗(yàn)的方式分析其表達(dá)差異；然后應(yīng)用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)特異性擴(kuò)增這49對(duì)癌組織及癌旁組織中肝臟內(nèi)HBV cccDNA，測(cè)序后分析HBV基因組的4個(gè)編碼調(diào)控區(qū)域preC/C, RT, X, preS中病毒cccDNA發(fā)生的突變，進(jìn)一步應(yīng)用3D-PCR深入比較癌組織和癌旁組織中cccDNA發(fā)生的G-A突變。通過(guò) RT-qPCR檢測(cè)了APOBEC3B家族在這49對(duì)癌組織及癌旁組

3、織中肝臟內(nèi)的表達(dá)差異，并通過(guò)Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證。最后在細(xì)胞體系中， HepAD38細(xì)胞中過(guò)表達(dá)APOBEC3B質(zhì)粒，研究其對(duì)cccDNA潛在的抑制作用。
　　結(jié)果：在49例患者中，在35例配對(duì)的癌組織和癌旁組織都檢測(cè)到了cccDNA，癌組織HBV cccDNA平均表達(dá)水平顯著低于癌旁組織中(p=0.003)，同時(shí)肝臟內(nèi)HBV cccDNA與HBV total DNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)性。通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增，我們分析了 HB

4、V cccDNA編碼preC/C和X區(qū)，發(fā)生G-A的突變最高，進(jìn)一步用3D-PCR發(fā)現(xiàn)癌組織 cccDNA的 preC/C區(qū)主要發(fā)生 G-A突變，突變率高于癌旁組織（3.9/1000bp vs0.12/1000bp），并且更多的G-A突變發(fā)生于GpA二聯(lián)核苷酸形式，表明APOBEC3可能參與了HCC中 cccDNA的剪切和降解。最后我們分析了APOBEC3家族7個(gè)基因在腫瘤組織和癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄水平：APOBEC3A、 APOBEC3B

5、和APOBEC3D在癌組織中上調(diào),而APOBEC3C、APOBEC3F、APOBEC3G和 APOBEC3H在癌組織下調(diào)，其中 APOBEC3B在癌組織的表達(dá)上調(diào)具有顯著性差異（P<0.05）。HepAD38細(xì)胞中過(guò)表達(dá)APOBEC3B，通過(guò)特異性熒光定量發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染 APOBEC3B表達(dá)質(zhì)粒后，其 HBV cccDNA水平降低，APOBEC3B對(duì)HBV cccDNA抑制率到達(dá)42.1％。
　　結(jié)論：腫瘤中HBV ccc