IL-35基因轉染及其對小鼠免疫功能的影響.pdf

1、目的：探討IL-35質粒載體體內基因轉染的可行性及其對小鼠免疫功能的影響。
　　 方法：(1)鑒定格拉斯哥大學惠贈的IL-35基因表達質粒載體(pSecTag2-IL35)。設計目的基因IL-35的上下游引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增目的基因IL-35；雙酶切質粒載體，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測目的核酸片段分子量的大?。?2)IL-35基因表達質粒載體和另一種綠熒光蛋白表達載體陽離子脂質體轉染法體外轉染人腎上皮細胞系29

2、3細胞，倒置熒光顯微鏡觀察293細胞綠熒光表達水平評估細胞轉染情況，流式細胞術(FCM)分析細胞的轉染效率，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞轉染后上清液中IL-35的濃度，分析IL-35基因表達情況；(3)采用鼠尾靜脈流體力學轉染技術將IL-35基因表達質粒載體和PBS緩沖液分別體內轉染BALB/c小鼠，流式細胞技術檢測轉染后小鼠外周血及脾臟CD4+CD8-T細胞、CD4-CD8+T細胞、CD3-CD16+NK細胞、CD4+CD25

3、+Treg比例；(4)利用密度梯度離心法分離純化體內轉染IL-35基因表達質粒載體的BALB/c(Ⅱ-2d)小鼠和C57BL/6(H-2b)小鼠脾臟單個核細胞，分別以經絲裂霉素處理的BALB/c和C57BL/6小鼠脾細胞作為刺激細胞，體內轉染后的未經絲裂霉素處理的BALB/c小鼠脾細胞作為反應細胞，進行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，觀察IL-35對培養(yǎng)體系細胞增殖的影響，以流式細胞技術檢測培養(yǎng)體系CD4+CD8-T細胞、CD4-CD8+T細胞、

4、CD4+CD25-Treg比例。
　　 結果：(1)通過瓊脂糖凝膠電泳的檢測，目的核酸片段的分子量大小均正確；(2)體外轉染后倒置熒光顯微鏡可以觀察到綠熒光蛋白表達，流式細胞術分析293細胞的轉染效率在35.30％，ELISA可檢測到IL-35基因表達的質粒載體轉染的細胞上清液中有IL-35的表達；(3)體內轉染IL-35可引起小鼠外周血及脾臟CD4+CD25+Treg比例的上調，外周血CD4+CD8-T細胞、CD3-CD16+

5、NK細胞比例的下調；(4)IL-35能上調同種異體混合淋巴細胞反應體系中的CD4+CD25+Treg水平，下調CD4+CD8-T細胞比例的水平。導致這些變化的原因可能是被轉染的小鼠表達了IL-35，引起了脾臟及外周血中CD4+CD25+Treg比例的上調，增強了Treg免疫調節(jié)的作用。
　　 結論：IL-35質粒載體體內轉染能誘導小鼠CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的增殖和分化，并間接或直接抑制CD4+T細胞的活化水平，抑制NK細