IL-35基因轉(zhuǎn)染及其對(duì)小鼠免疫功能的影響.pdf

1、目的：探討IL-35質(zhì)粒載體體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的可行性及其對(duì)小鼠免疫功能的影響。
　　 方法：(1)鑒定格拉斯哥大學(xué)惠贈(zèng)的IL-35基因表達(dá)質(zhì)粒載體(pSecTag2-IL35)。設(shè)計(jì)目的基因IL-35的上下游引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增目的基因IL-35；雙酶切質(zhì)粒載體，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)目的核酸片段分子量的大小；(2)IL-35基因表達(dá)質(zhì)粒載體和另一種綠熒光蛋白表達(dá)載體陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法體外轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞系29

2、3細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察293細(xì)胞綠熒光表達(dá)水平評(píng)估細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后上清液中IL-35的濃度，分析IL-35基因表達(dá)情況；(3)采用鼠尾靜脈流體力學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)將IL-35基因表達(dá)質(zhì)粒載體和PBS緩沖液分別體內(nèi)轉(zhuǎn)染BALB/c小鼠，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后小鼠外周血及脾臟CD4+CD8-T細(xì)胞、CD4-CD8+T細(xì)胞、CD3-CD16+NK細(xì)胞、CD4+CD25

3、+Treg比例；(4)利用密度梯度離心法分離純化體內(nèi)轉(zhuǎn)染IL-35基因表達(dá)質(zhì)粒載體的BALB/c(Ⅱ-2d)小鼠和C57BL/6(H-2b)小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，分別以經(jīng)絲裂霉素處理的BALB/c和C57BL/6小鼠脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，體內(nèi)轉(zhuǎn)染后的未經(jīng)絲裂霉素處理的BALB/c小鼠脾細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，觀察IL-35對(duì)培養(yǎng)體系細(xì)胞增殖的影響，以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)體系CD4+CD8-T細(xì)胞、CD4-CD8+T細(xì)胞、

4、CD4+CD25-Treg比例。
　　 結(jié)果：(1)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)，目的核酸片段的分子量大小均正確；(2)體外轉(zhuǎn)染后倒置熒光顯微鏡可以觀察到綠熒光蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)分析293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率在35.30％，ELISA可檢測(cè)到IL-35基因表達(dá)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液中有IL-35的表達(dá)；(3)體內(nèi)轉(zhuǎn)染IL-35可引起小鼠外周血及脾臟CD4+CD25+Treg比例的上調(diào)，外周血CD4+CD8-T細(xì)胞、CD3-CD16+

5、NK細(xì)胞比例的下調(diào)；(4)IL-35能上調(diào)同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中的CD4+CD25+Treg水平，下調(diào)CD4+CD8-T細(xì)胞比例的水平。導(dǎo)致這些變化的原因可能是被轉(zhuǎn)染的小鼠表達(dá)了IL-35，引起了脾臟及外周血中CD4+CD25+Treg比例的上調(diào)，增強(qiáng)了Treg免疫調(diào)節(jié)的作用。
　　 結(jié)論：IL-35質(zhì)粒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染能誘導(dǎo)小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖和分化，并間接或直接抑制CD4+T細(xì)胞的活化水平，抑制NK細(xì)