IL-35修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)性能初探.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗通過分離大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），使用攜帶IL-35基因片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MSCs細(xì)胞，在體外建立MSCs與DC、T細(xì)胞共培養(yǎng)體系，探討修飾后的MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　方法：
　　(1)無菌條件下分離Sprague-Dawley（SD）大鼠股骨和脛骨，使用全骨髓貼壁法培養(yǎng)MSCs，胰酶消化傳代培養(yǎng)。待培養(yǎng)至第3代時進(jìn)行流式檢測，鑒定分離的MSCs

2、體外分化的潛能。(2)使用LPS處理3天的人外周血單核細(xì)胞cDNA為模板，擴(kuò)增獲得EBi3和p35基因片段，再通過重疊PCR方法，人工合成了IL-35片段，將其克隆進(jìn)真核表達(dá)載體 pMSCV-IRES-GFP中，提取質(zhì)粒后瞬時轉(zhuǎn)染MSCs，Real-time PCR檢測修飾后的MSCs基因表達(dá)情況，ELISA檢測細(xì)胞上清中 IL-10、TGF-β1、IL-12的分泌情況。(3)密度梯度離心法分離培養(yǎng) Wistar大鼠骨髓未成熟DC細(xì)胞，

3、建立修飾后的MSCs與DC細(xì)胞的體外共培養(yǎng)體系，分為直接接觸組和間接接觸組，流式檢測共培養(yǎng)48小時后DC表型的變化，ELISA檢測DC細(xì)胞分泌IL-12的變化情況。(4)建立修飾后的MSCs與脾臟T細(xì)胞的體外共培養(yǎng)體系，分為直接接觸組和間接接觸組，流式檢測CD8+T細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Tregs）水平，MTS檢測T細(xì)胞增殖，Real-time PCR檢測與T細(xì)胞共培養(yǎng)后MSCs的IL-10和TGF-β基因表達(dá)情況。

4、>　　結(jié)果：
　　(1)使用全骨髓貼壁法培養(yǎng)的MSCs成細(xì)長梭形狀，形似成纖維細(xì)胞，排列均勻，成漩渦狀生長，流式檢測其高表達(dá)CD29、CD44和CD90分子，分別為84.12％、90.77%、97.27%，而幾乎不表達(dá)造血系的CD34和CD45分子，分別為1.87%、1.06%。證實(shí)所獲得的MSCs為典型的間充質(zhì)干細(xì)胞，第三代MSCs在體外經(jīng)誘導(dǎo)后可向脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化，證實(shí)其具有良好的分化潛能。
　　(2) PCR擴(kuò)增

5、獲得630bp的EBi3片段和590bp的p35成熟片段，通過重疊PCR的方法，人工合成了IL-35基因片段（1.3kb），并成功將其克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pMSCV-IRES-GFP中，雙酶切鑒定顯示連接成功。提取質(zhì)粒后瞬時轉(zhuǎn)染MSCs，檢測到修飾后MSCs表達(dá)IL-35顯著增強(qiáng)，同時與IL-35相關(guān)的免疫因子IL-10和TGF-β1的表達(dá)也明顯升高。ELISA檢測細(xì)胞上清顯示轉(zhuǎn)染修飾的MSCs分泌IL-10和TGF-β1水平明顯增高，而

6、IL-12的分泌水平明顯下降。
　　(3)通過密度梯度離心法獲得大鼠DC，流式檢測其表面成熟分子標(biāo)志物CD86、CD11b/c、MHC-Ⅱ處于較低水平，分別為45.11%、70.15%、82.56%。使用LPS誘導(dǎo)后，CD86、CD11b/c、MHC-Ⅱ水平明顯升高，分別為78.2%、97.1%、99.47%。在MSCs與DC共培養(yǎng)體系中加入LPS誘導(dǎo)DC成熟，DC的最主要成熟標(biāo)志CD86仍處于較低水平，MSC-IL35組和直接接

7、觸組中顯示出更強(qiáng)勁抑制效力。共培養(yǎng)后細(xì)胞上清ELISA顯示DC分泌的IL-12水平明顯下降，且在MSC-IL35組下降更為明顯。
　　(4)通過紅細(xì)胞裂解法獲得大鼠脾臟T細(xì)胞，MSCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)后降低了CD8+T水平，增加了CD4+CD25+Tregs水平，MSC-IL-35的作用更為明顯，MTS檢測顯示在共培養(yǎng)后24小時和48小時，MSCs明顯抑制了T細(xì)胞的增殖，而MSC-IL-35的抑制作用更加明顯。Real-time P