IL-35誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞免疫逃逸的作用及機(jī)制.pdf

1、急性髓細(xì)胞白血?。ˋcute Myeloid Leukemia, AML）是最常見(jiàn)的成人血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，基因突變、遺傳物質(zhì)異常以及免疫功能缺陷等因素均是造成 AML完全發(fā)病的重要因素。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（CD4+CD25+Regulatory T Cells, Tregs）是一群具有免疫抑制作用的特殊細(xì)胞亞群，其既可以通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸方式直接殺傷效應(yīng)性免疫細(xì)胞，又可以通過(guò)分泌 IL-10和TGF-β等細(xì)

2、胞因子以非細(xì)胞接觸方式抑制免疫應(yīng)答，從而在誘導(dǎo)和維持機(jī)體的免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮重要作用。我們前期工作基礎(chǔ)和其他學(xué)者多項(xiàng)研究均表明，初診AML患者外周血和骨髓中Tregs比例均顯著高于健康對(duì)照組，其不僅顯著抑制 CD4+CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞（CD4+CD25-Effector T Cells, Teffs）的增殖和分泌細(xì)胞因子，還顯著抑制過(guò)繼性輸入的腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL

3、s）的增殖和擴(kuò)散，故Tregs被認(rèn)為是誘導(dǎo)AML細(xì)胞逃逸機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素，為AML患者提供了一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。然而，最新研究表明單純利用抗 CD25單克隆抗體或者白喉毒素/IL-2融合蛋白等方法去除Tregs，還是只能給 AML荷瘤小鼠帶來(lái)短暫性療效，因?yàn)槟[瘤微環(huán)境能夠很快再次誘導(dǎo)Tregs的表達(dá)；同時(shí)，利用中和性抗體的方法中和掉IL-10或TGF-β的活性，也并不能完全阻斷Tregs的免疫抑制作用，這提示Tregs的體內(nèi)

4、表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，而且除了經(jīng)典的抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，或許還有其他細(xì)胞因子介導(dǎo)了它的免疫調(diào)節(jié)作用，這給以其為靶點(diǎn)的AML治療帶來(lái)了實(shí)際困難。
　　IL-35是一種近年發(fā)現(xiàn)的的新型細(xì)胞因子，其屬于 IL-12細(xì)胞因子家族，由IL-12α亞基p35和IL-27β亞基EB病毒誘導(dǎo)的基因3（Epstein-Barr Virus Induced Gene3, EBI3）以異二聚體形式組成。在細(xì)胞來(lái)源方面，目前研究表明小鼠

5、IL-35可能特異性來(lái)源于Tregs，但人Tregs是否產(chǎn)生IL-35目前尚存在爭(zhēng)議，且基因組學(xué)研究提示除Tregs之外，IL-35可能有著更為廣泛的細(xì)胞來(lái)源；在生物學(xué)功能方面，IL-35被認(rèn)為具有強(qiáng)大的免疫抑制作用，其不僅能直接抑制 Teffs的分化、增殖和分泌細(xì)胞因子，又能招募髓系來(lái)源的抑制性細(xì)胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）聚集并促進(jìn)血管生成，還能促進(jìn)Tregs的增殖并為其發(fā)揮最

6、大免疫抑制功能所必需，甚至還能誘導(dǎo)產(chǎn)生一種 Tregs新亞群“iTr35”（IL-35 Induced Regulatory T Cells, iTr35），從而級(jí)聯(lián)放大Tregs的免疫調(diào)節(jié)作用。綜上所述，IL-35作為 IL-12細(xì)胞因子家族的一個(gè)新成員，其無(wú)論是來(lái)源方面還是功能方面，均與Tregs密切相關(guān)。因此，我們認(rèn)為IL-35的發(fā)現(xiàn)正好為闡明Tregs在AML中的表達(dá)調(diào)控及作用機(jī)制帶來(lái)了良好的契機(jī)，本文即以此為出發(fā)點(diǎn)來(lái)展開(kāi)研究，

7、以期進(jìn)一步揭示AML細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，并同時(shí)探討通過(guò)干預(yù)IL-35的表達(dá)而提高免疫細(xì)胞殺傷AML細(xì)胞能力的方法，以期為AML免疫治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新思路。
　　本研究共收集了28例初診成人AML患者及其在首次獲得完全緩解（27例）和首次復(fù)發(fā)（7例）時(shí)的外周血標(biāo)本，同時(shí)選擇了30例年齡匹配的健康成年人外周血標(biāo)本作為對(duì)照，然后對(duì)IL-35在AML中的表達(dá)、來(lái)源、誘導(dǎo)AML細(xì)胞免疫逃逸的作用和機(jī)制，以及干預(yù)IL-35的表達(dá)對(duì)免疫細(xì)胞殺

8、傷AML細(xì)胞活性的影響進(jìn)行了分析。具體實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）我們通過(guò)對(duì)常見(jiàn)免疫細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AML患者外周循環(huán)中NKT、B、CD8+T、總CD4+T、Th1、Th17、IL-15、sCD25、IL-2、IFN-γ以及 IL-17等效應(yīng)性免疫細(xì)胞和炎癥因子明顯低于健康對(duì)照組，而Th2、Tregs、IL-4、IL-10以及TGF-β等調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞和抗炎因子明顯高于健康對(duì)照組，這提示AML患者處于明顯的

9、免疫功能紊亂狀態(tài)，有利于AML細(xì)胞逃逸機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)而得到惡性生長(zhǎng)和增殖。
　?。?）我們通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)IL-35蛋白和mRNA的分析，發(fā)現(xiàn)初診AML患者的IL-35表達(dá)水平與健康對(duì)照組相比顯著升高，且在獲得完全緩解后降低，而復(fù)發(fā)時(shí)再度升高，這提示AML患者體內(nèi)存在IL-35的高表達(dá)且與其疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是介導(dǎo)AML細(xì)胞免疫逃逸的重要因素。
　?。?）我們分離純化了部分初診AML患者的Tregs、Te

10、ffs以及AML細(xì)胞，并將其進(jìn)行了短期的體外培養(yǎng)和刺激，然后在靜息和活化狀態(tài)下對(duì)它們是否表達(dá)IL-35做了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tregs在靜息狀態(tài)下不表達(dá)IL-35但經(jīng)活化后顯著表達(dá)，同時(shí)部分患者來(lái)源的AML細(xì)胞亦表達(dá)IL-35，但Teffs無(wú)論是靜息還是活化狀態(tài)下均不表達(dá)IL-35；另外，我們還檢測(cè)了AML患者體內(nèi)iTr35的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其顯著高于健康對(duì)照組且在靜息和活化狀態(tài)下均表達(dá)IL-35；這提示AML中Tregs、iTr35和AML

11、細(xì)胞均是IL-35表達(dá)的細(xì)胞來(lái)源之一。
　　（4）我們通過(guò)Teffs、Tregs和iTr35體外刺激實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IL-35顯著抑制Teffs的增殖及其殺傷AML細(xì)胞的活性，同時(shí)又顯著促進(jìn)Tregs和iTr35的擴(kuò)增，并且這種IL-35擴(kuò)增的Tregs和iTr35對(duì)Teffs的增殖具有顯著抑制作用，這提示IL-35不僅能直接抑制Teffs的免疫應(yīng)答，還能促進(jìn)Tregs和iTr35的表達(dá)和功能，從而介導(dǎo)了AML細(xì)胞免疫逃

12、逸。
　　（5）我們通過(guò)對(duì)IL-35刺激的AML細(xì)胞增殖和凋亡情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)IL-35顯著上調(diào)AML細(xì)胞中IL-35R的表達(dá)，同時(shí)與PBS對(duì)照組相比IL-35還顯著促進(jìn)AML細(xì)胞的增殖，而且發(fā)現(xiàn)用IL-35預(yù)刺激的AML細(xì)胞能顯著抵抗VP-16誘導(dǎo)的凋亡，這提示IL-35可以通過(guò)結(jié)合其受體直接作用于AML細(xì)胞，并顯著促進(jìn)AML細(xì)胞的增殖和抑制AML細(xì)胞的凋亡。
　?。?）細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（Cytokine-Indu

13、ced Killer Cells, CIK）是AML過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療的首選方案，然而其療效有待進(jìn)一步提高。本研究中我們通過(guò)免疫表型分析和細(xì)胞因子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的CIK細(xì)胞中包含有大量的Tregs及其分泌的IL-35，嚴(yán)重影響了其最大免疫殺傷活性；故我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中對(duì)體外制備CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方案進(jìn)行了優(yōu)化，即將方案中的淋巴細(xì)胞活化因子由IL-2更換成了IL-15，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)IL-2擴(kuò)增的CIK細(xì)胞相比，IL-15擴(kuò)增的CIK細(xì)胞中T

14、regs和IL-35的表達(dá)顯著下調(diào)，但對(duì)AML細(xì)胞的殺傷活性卻顯著增強(qiáng)，這提示干預(yù)Tregs和IL-35的表達(dá)能顯著提高CIK細(xì)胞殺傷AML細(xì)胞能力。
　?。?）將樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic Cells, DCs）與CIK細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)（即DC-CIK細(xì)胞）是近年進(jìn)一步活化CIK細(xì)胞的有效方法，其可以通過(guò)抗原提呈途徑顯著增強(qiáng) CIK細(xì)胞的抗腫瘤能力，然而通過(guò)DC-CIK細(xì)胞與CIK細(xì)胞的生物特性及其對(duì)AML細(xì)胞抗腫瘤活性的比較分

15、析，我們發(fā)現(xiàn)與CIK細(xì)胞相比，DC-CIK細(xì)胞中Tregs和IL-35的表達(dá)顯著下調(diào)，但對(duì)AML細(xì)胞的殺傷活性卻顯著增強(qiáng)，這提示通過(guò)下調(diào)Tregs和IL-35的表達(dá)也是DCs提高CIK細(xì)胞對(duì)AML細(xì)胞殺傷活性的重要途徑之一。
　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)，AML患者體內(nèi)存在嚴(yán)重的免疫功能紊亂，其中，近年發(fā)現(xiàn)的新型細(xì)胞因子IL-35表達(dá)水平顯著升高且與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；這些IL-35既可以來(lái)源于Tregs和iTr35，又可以來(lái)源于部分A

16、ML細(xì)胞；IL-35可以通過(guò)抑制Teffs和促進(jìn) Tregs和iTr35的表達(dá)和功能以及直接促進(jìn) AML細(xì)胞的增殖和抑制AML細(xì)胞的凋亡來(lái)誘導(dǎo)AML細(xì)胞的免疫逃逸；同時(shí)，Tregs及其分泌的IL-35還是影響CIK細(xì)胞殺傷AML細(xì)胞活性的重要因素，而通過(guò)利用IL-15替代IL-2制備的CIK細(xì)胞或?qū)IK細(xì)胞與DCs共培養(yǎng)，可以通過(guò)下調(diào)Tregs和IL-35的表達(dá)而顯著提高其殺傷AML細(xì)胞的能力。因此，我們認(rèn)為IL-35在AML細(xì)胞免疫