miR--31抑制血管緊張素2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　高血壓作為心血管系統(tǒng)最常見病癥之一，影響全球患者多達(dá)10億。盡管醫(yī)療水平不斷提高，但目前中國高血壓疾病發(fā)病率較高，病情知曉率、疾病治療率及血壓控制率仍較低。血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)作為血壓升高后最直接影響的被膜細(xì)胞，其功能異常會導(dǎo)致炎癥介質(zhì)和促凝因子釋放，遷移能力下降，引起血管舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心臟、腦、腎臟、眼以及大小血管等不同部位嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前ECs、腎素-血管緊張素-醛固

2、酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS)等因素均被認(rèn)為與高血壓發(fā)病機(jī)制相關(guān)。其中血管緊張素2(AngiotensionⅡ，AngⅡ)作為RAAS中最重要的血管活性物質(zhì)。不僅可引起機(jī)體血流動力學(xué)改變，導(dǎo)致高血壓的發(fā)生，而且對血管內(nèi)皮功能起著非常重要的作用。因此對高血壓造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制研究就顯得尤為重要。
　　微小RNA(MicroRNA，miRNA)作為一種內(nèi)源性的非編碼RNA

3、，能夠與靶向mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'untranslation region，3'UTR)結(jié)合，使其翻譯過程阻斷或引起靶mRNA的降解。近年來已有大量文獻(xiàn)報道了miRNA可通過影響細(xì)胞的凋亡、增殖、代謝、分化等生物學(xué)過程，參與調(diào)節(jié)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-31在心肌纖維化，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型轉(zhuǎn)化，以及心肌缺血/再灌注損傷具有調(diào)節(jié)作用。然而miR-

4、31在高血壓疾病中內(nèi)皮功能障礙的作用和機(jī)制尚未闡明。
　　本研究旨在探究miR-31在高血壓發(fā)病過程中對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及機(jī)制。
　　方法:
　　1.通過酶消化法獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs);通過AngⅡ（1μmol/L）誘導(dǎo)HUVECs建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，對內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能進(jìn)行檢測，包括流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、western

5、blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，CCK8法檢測細(xì)胞生長活力;通過實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測miRNA的表達(dá)。
　　2.利用miR-31模擬物/抑制物分別轉(zhuǎn)染HUVECs，并通過qRT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染效率;CCK-8法檢測生長活力變化;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化;平板劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力變化。
　　3.生物信息學(xué)

6、預(yù)測軟件檢索miR-31的潛在靶基因，分析miR-31與潛在靶基因3'UTR的結(jié)合位點(diǎn);在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染已構(gòu)建的螢火蟲熒光素酶表達(dá)載體，通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蛍estern blot驗證miR-31與靶基因的調(diào)控關(guān)系;通過拯救實驗，明確miR-31與靶基因在AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs損傷中的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.AngⅡ刺激HUVECs后，CCK8結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞生長活力明顯降低(P＜0.01);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)

7、果確定細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.01);western blot結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)。qRT-PCR結(jié)果顯示AngⅡ刺激后，miR-126、miR-200和miR-221無明顯變化(P＞0.05);miR-155表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01);miR-31、miR-384和miR-590表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)。其中miR-31在AngⅡ刺激不同時間(12h、24h、36h和48h)后均

8、表達(dá)降低(P＜0.01)，其中24h變化最明顯。
　　2.轉(zhuǎn)染后，CCK-8檢測結(jié)果表明過表達(dá)miR-31的細(xì)胞生長活力明顯增加(P＜0.01)，而敲低miR-31的細(xì)胞生長活力明顯減弱(P＜0.01);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-31的細(xì)胞凋亡率減少(P＜0.01)，而敲低miR-31的細(xì)胞凋亡率增加(P＜0.01);細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示過表達(dá)miR-31的細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，而敲低miR-31的細(xì)胞遷移能力減弱。
　　

9、3.生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果顯示RASA1基因的3'UTR上存在miR-31的潛在結(jié)合位點(diǎn);雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-31顯著降低含RASA1基因3'UTR序列的熒光素酶活性(P＜0.01);western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-31能夠顯著抑制RASA1的蛋白表達(dá)(P＜0.01);拯救實驗結(jié)果證實過表達(dá)miR-31對AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs凋亡的保護(hù)是通過抑制RASA1表達(dá)實現(xiàn)的。
　　結(jié)論: