貪噬菌Variovorax boronicumulans J1降解煙堿類殺蟲劑噻蟲啉機(jī)制的研究.pdf

1、中文 摘 耍中文 摘 要本 文 主 要 研 究 了貪 卩 楚菌 Vari ovorax boroni cum ulans J1 降 解 煙 堿 類 殺 蟲 劑 噻 蟲啉 （ T H I) 的機(jī) 制 ， 克 隆 了 K boroni cum ul ans J1 的腈 水 合 酶 基 因及 其 激 活 蛋 白基因，并在 E scheri chi a col iB L2 1( D E 3)中表達(dá) 了具有 T H I 水解活性 的腈水合酶

2、 。本 實(shí) 驗(yàn) 室 前期 研 究 發(fā) 現(xiàn) 貪 噬 菌 V bom ni ct m ul c m s 31 可 降解 T H I，液 相 色 譜 和質(zhì) 譜 聯(lián) 用 分 析 顯 示 ，轉(zhuǎn) 化 產(chǎn)物 的分 子 量 為 27 1(M + H 20 ), 與 酰 胺 _噻 蟲 啉 （ T H Iam i de) 的分 子 量 一 致 ， 表 明 J1 菌 株 可 以作用 于 T H I 的氰基 基 團(tuán)使其 轉(zhuǎn) 化 為 酰胺基 ，與腈 水 合 酶

3、 的作用 方式 一 致 。本 文進(jìn) 一 步研 究 了在 該過 程 中其 關(guān) 鍵 作 用 的腈水 合 酶 ，利 用 兼 并 引物 、反 向 P C R 等方法 從 V boroni cum ul ans J1 基 因組 上 克 隆出 2. 6 K b 長 的 D N A 序 列 ， 它包 含 完 整 的腈水 合酶 基 因及 其下 游 的激 活 蛋 白基 因 。其中腈水合酶基因全長 1304 bp，包括長 642 bp 的 a 亞基和

4、長 666 bp 的 p 亞基；激活蛋白基因全長 378 bp 。 對(duì)腈水合酶基 因的核酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析 ， 確定 該腈 水 合 酶 為 鈷 離 子 型 腈 水 合 酶 。將 腈 水 合 酶 基 因和 激 活 蛋 白基 因一起 或 單獨(dú) 與 表 達(dá) 載 體 PE T- 28a 連 接 并 導(dǎo)入 宿 主菌 E . coliB L 2 1 進(jìn) 行 異源 表 達(dá) 。 SD S -PA G E 和 W estern B lot 檢

5、 測(cè) 到 目的 蛋 白的 表 達(dá) 。 過 表 達(dá) 菌 株 E . col iB L 21( D E 3)- pE T 28a- N H ase 和 E . col iB L21( D E3)- pET28a- N H J 的靜息細(xì)胞均可轉(zhuǎn)化 TH I，且后者顯示比甜者有更高的腈水合酶活性；而不含腈水合酶基因的空質(zhì)粒 五 . co/ /B L21(D E 3)- pET 28a 則不能將轉(zhuǎn)化 T H I。轉(zhuǎn) 化 液 經(jīng) H P L C

6、分析 顯 示 ，產(chǎn) 物 的保 留時(shí) 間和 T H Iam i de 相 同 ；質(zhì)譜 分 析 顯 示 轉(zhuǎn) 化 產(chǎn) 物 與 T H Iam ide 的分 子 量 相 同 ：核 磁 共 振 分 析 表 明該 產(chǎn) 物 與T H Iam i de 的碳 譜 和 氧 譜 數(shù) 據(jù) 相 同 。上述 結(jié) 果表 明 ， 以 oraw ' cww w/ am 1J1 菌 株 的腈 水合酶是 將 T H I 水解 為 T H Iam i de 的關(guān)鍵

7、酶 ， 其下 游 的激 活 蛋 白基 因編 碼 對(duì)腈水 合 酶有 活 化 功 能 的激 活 蛋 白 。 腈 水 合 酶 底 物 特 異 性 研 究表 明 ，含 表 達(dá) 蛋 白腈 水合酶 的 E . col iB L 21(D E 3)菌株還可將 3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化為煙酰胺 。相關(guān) V boroni cum ul ans J1 代 謝 T H I 及 其腈 水 合 酶 的研 究 目前 尚未 見有 報(bào) 道 ，本 文 首次 開展 了 V bo

8、roni cum ul ans J1 腈 水合 酶 的研 究 ，對(duì) 于 微 生物 代 謝 和 降解T H I 及 其 它 腈 類 化 合 物 具 有 重 要 的價(jià) 值 。關(guān) 鍵 詞 ：貪 噬 菌 ，腈 水 合 酶 ，噻 蟲啉 ，酰 胺 -噻 蟲 琳 ， 高 效 液 相 色 譜 ，蛋 白印跡A B S T R A C TB iotransform ati on of T H Iby V boroni cum ul ans J1an d t

9、 h e st udy on ni t ril eh ydratase of V boron i cum ul ans J1have not been report ed .T his research i nvestigatedth e ni tri l e hydratase of V boron i cum ul ans J1 for t h e fi rst ti m e， w hich is very val uabl

10、efor the study of m etabol i sm of neoni coti noi d i nsect i ci de t hi acl opri d an d ot her ni t ri l ecom pounds by m i croorganism .K ey w ords：H PL C ,ni t ri l e hydratase,SD S- PA G E ,t hi acl opri d,t hi