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文檔簡介
1、人類至今對腦的奧秘知之甚少,揭示腦的工作原理是當代自然科學最大的挑戰(zhàn)之一。神經(jīng)元是大腦的基本組成單位,神經(jīng)元網(wǎng)絡的信息感知、處理、傳遞機制是大腦高級活動的基礎。因此,對大腦功能機制研究的一個有效途徑在于對神經(jīng)元的信號傳遞特性和對外界刺激的響應特性進行研究。本課題組首次提出了采用電壓閾值測定法評價待測因素對神經(jīng)元網(wǎng)絡電興奮性的影響,該方法具有快速、定量等優(yōu)點,并且課題組前期利用了該方法對溫度、酒精、乙酰膽堿等具有單向變化規(guī)律的外界因素進行
2、研究。本論文選用具有雙相作用的鹽酸利多卡因作為研究對象,利用微電極陣列技術,通過對類神經(jīng)元細胞網(wǎng)絡(PC12細胞網(wǎng)絡)和神經(jīng)組織(大鼠海馬腦片)在鹽酸利多卡因作用下電刺激響應特性進行了初步研究,定量地分析了不同濃度鹽酸利多卡因對PC12細胞網(wǎng)絡和大鼠海馬腦片電興奮性的影響。另外本論文還進行了PC12細胞網(wǎng)絡在不同濃度鹽酸利多卡因作用下高內涵細胞組學實驗,并與電壓閾值測定法實驗結果進行對比分析。
本論文首先在MEA上培養(yǎng)PC12
3、細胞網(wǎng)絡形成類神經(jīng)元網(wǎng)絡,通過對不同濃度鹽酸利多卡因作用下PC12細胞網(wǎng)絡的電刺激響應信號探測實驗,獲得了PC12細胞網(wǎng)絡在各個濃度鹽酸利多卡因作用下的電刺激電壓閾值。根據(jù)PC12細胞網(wǎng)絡刺激電刺激電壓閾值隨鹽酸利多卡因濃度的變化曲線,定量地分析了不同濃度鹽酸利多卡因對PC12細胞網(wǎng)絡電興奮性的影響。結果顯示: PC12細胞網(wǎng)絡在鹽酸利多卡因作用下電興奮性的變化具有濃度依賴性。當鹽酸利多卡因濃度在0.1~1.2μg/mL之間可抑制PC1
4、2細胞網(wǎng)絡電興奮性,即產(chǎn)生麻醉作用,其麻醉效果先隨濃度增加呈正相關性,在濃度為0.5μg/mL時達到最佳麻醉效果,然后隨濃度繼續(xù)增加而呈負相關性。而當濃度超過1.2μg/mL后鹽酸利多卡因可增強PC12細胞網(wǎng)絡電興奮性,即產(chǎn)生興奮作用。且其興奮作用隨濃度增加而呈正相關性。但當鹽酸利多卡因濃度超過1.5μg/mL后,PC12細胞網(wǎng)絡達到并維持在較高的興奮狀態(tài),且僅需最小量(1mV)的電刺激即可持續(xù)爆發(fā)響應信號。實驗結果與文獻報道相近。
5、r> 然后本論文又制備了12~14天SD大鼠海馬腦片,進行了0.1~5μg/mL范圍內多個濃度鹽酸利多卡因作用下大鼠海馬腦片的電刺激響應信號探測實驗,獲得了大鼠海馬腦片在各個濃度鹽酸利多卡因作用下的電刺激電壓閾值。根據(jù)大鼠海馬腦片電刺激電壓閾值隨鹽酸利多卡因濃度的變化曲線,定量地分析了不同濃度鹽酸利多卡因對大鼠海馬腦片電興奮性的影響。實驗獲得了與PC12細胞網(wǎng)絡部分、文獻報道相近的結果,即大鼠海馬腦片在鹽酸利多卡因作用下電興奮性的變化
6、具有濃度依賴性。當鹽酸利多卡因濃度在0.1~1.2μg/mL之間可抑制大鼠海馬腦片電興奮性,即產(chǎn)生麻醉作用,且其麻醉效果先隨濃度增加呈正相關性,在0.6μg/mL時達到最佳效果,然后隨濃度繼續(xù)增加而呈負相關性。而當濃度超過1.3μg/mL后鹽酸利多卡因可增強大鼠海馬腦片電興奮性,即產(chǎn)生興奮作用。且在1.3~1.5μg/mL范圍內鹽酸利多卡因對大鼠海馬腦片的興奮作用隨濃度增加而呈正相關性。但當鹽酸利多卡因濃度超過1.5μg/mL后,大鼠海
7、馬腦片達到并維持在較高的興奮狀態(tài),且僅需最小量(1mV)的電刺激即可爆發(fā)響應信號。
最后采用高內涵細胞組學分析系統(tǒng)對不同濃度鹽酸利多卡因急性作用后的PC12細胞網(wǎng)絡進行了熒光成像分析。首先采用PI染色方法對凋亡細胞進行標記,分析了0~1.7μg/mL濃度鹽酸利多卡因急性作用15分鐘后PC12細胞的凋亡程度。實驗結果顯示,鹽酸利多卡因急性作用后PC12細胞的PI染色呈陰性,PC12細胞無凋亡現(xiàn)象,表明此濃度范圍內鹽酸利多卡因的急
8、性作用不會導致PC12細胞凋亡。隨后采用鬼筆環(huán)肽染色方法對PC12細胞的細胞骨架進行標記,分析了0~1.7μg/mL濃度鹽酸利多卡因急性作用15分鐘后PC12細胞的突起長度、面積的變化。結果顯示,實驗組與對照組中每個細胞的平均突起長度、面積具有明顯差別。鹽酸利多卡因急性作用后PC12細胞的平均每個細胞突起長度、面積具有濃度依賴性,其變化規(guī)律與電刺激電壓閾值隨鹽酸利多卡因濃度變化的規(guī)律一致,從細胞組學角度(突起特性)驗證了電壓閾值法的結果
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