“更年春”對β-淀粉樣蛋白致PC12細(xì)胞和大鼠海馬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、圍絕經(jīng)期綜合征是指婦女在絕經(jīng)前后由于卵巢功能衰退所引起的一系列軀體和精神心理的癥狀,中醫(yī)認(rèn)為圍絕經(jīng)期綜合征相當(dāng)于“絕經(jīng)前后諸癥”,以腎精氣虧損為本。部分患者除了會出現(xiàn)血管舒縮癥狀、神經(jīng)精神癥狀外,絕經(jīng)中遠(yuǎn)期還會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、學(xué)習(xí)記憶能力減退甚至阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)。AD是一種以進(jìn)行性癡呆為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其特征性病理改變是腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié),并伴有突觸和神經(jīng)元缺失。β-淀

2、粉樣蛋白(β-amy loid protein,Aβ)是構(gòu)成AD特征性病理改變老年斑核心的主要物質(zhì)。
　　補(bǔ)腎中藥“更年春”(GNC)方,以滋腎柔肝清心瀉火為治則制成,臨床驗證治療更年期綜合征療效良好,尤其可以改善大腦功能,增強(qiáng)記憶能力。既往實驗發(fā)現(xiàn)GNC可能通過提高雌激素受體含量對神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)起良性調(diào)控作用,GNC可以提高大鼠切除卵巢后Morris水迷宮成績;GNC可能通過提高海馬中ErβmRNA和蛋白的表達(dá)、調(diào)節(jié)海馬膽堿

3、能指標(biāo)而改善學(xué)習(xí)和記憶能力低下;GNC不引起子宮內(nèi)膜增生,提示中藥對改善學(xué)習(xí)和記憶能力低下有潛在的應(yīng)用前景。
　　為進(jìn)一步證實GNC方的作用,我們采用Aβ25-35嗡作用于PC12細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞,建立AD的細(xì)胞模型,并探索GNC含藥血清對受損神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。
　　第-部分“更年春”一對Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　目的:研究中藥“更年春”對Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷的

4、保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。
　　方法:三月齡SD雌性大鼠去勢后隨機(jī)分為兩組:一組去勢雌性大鼠灌服相當(dāng)于成人10倍劑量的中藥更年春方顆粒溶液,取血制備大鼠含藥血清(MRS);另一組去勢雌性大鼠灌服相應(yīng)劑量的生理鹽水,取血制備去勢大鼠血清(NRS)。不同濃度MRS和NRS以5％、10％、20％培養(yǎng)PCI2細(xì)胞24 h和48 h,CCK-8方法檢測細(xì)胞活力,摸索含藥血清作用細(xì)胞的合適濃度和時間。分別以5μ M、10μM、20μ M、50

5、μ MAβ25-35處理PCI2細(xì)胞24 h和48 h,CCK-8測定細(xì)胞活力,選擇合適濃度以建立阿爾茨海默病細(xì)胞模型。設(shè)立實驗分組為正常組、含藥血清組、NGF組、普通去勢大鼠血清組、模型組,加入Aβ25-35后培養(yǎng)24 h用于后續(xù)檢測。CCK-8法檢測各組的細(xì)胞活力;Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測PCI2細(xì)胞的早期細(xì)胞凋亡率;western blotting方法檢測各組細(xì)胞Bc1-2,Bax和active ca

6、spase-3的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1)PC12細(xì)胞培養(yǎng)24 h和48 h,同一濃度的MRS組比NRS組有更高的細(xì)胞活力,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01),且隨著血清濃度升高,培養(yǎng)時間延長,細(xì)胞活力有所升高,并在20％的MRS組細(xì)胞活力最高。
　　2)Aβ25-35使PC12細(xì)胞活力降低,終濃度為5μ mol/L(M)、10μM、20μ M、50μ M的Aβ25-35作用于PC12細(xì)胞,培養(yǎng)24 h和48

7、h后,隨著Aβ25-35作用濃度的增加,細(xì)胞活力逐漸下降,并與濃度呈負(fù)相關(guān)性,相鄰濃度組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p﹤0.01)。
　　3)與模型組比較,MRS組的細(xì)胞活力顯著升高(與NGF組相當(dāng)),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　4)與模型組比較,MRS組早期凋亡率顯著降低(與NGF組相當(dāng)),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　5)與模型組比較,Bax與bc1-2表達(dá)比例在MRS組中明顯降低(與NGF組相當(dāng),

8、p＜0.01);與bax和bc1-2的表達(dá)相對應(yīng)的,active caspase-3在MRS組中表達(dá)顯著降低(與NGF組相當(dāng),p＜0.01)。
　　結(jié)論:MRS可以提高PC12細(xì)胞活力,濃度越高,細(xì)胞活力越高;Aβ25-35對PC12細(xì)胞具有毒性作用,有明顯的劑量依賴性,也有一定時間依賴性:MRS對Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷有保護(hù)作用,可提高細(xì)胞活力,降低早期凋亡率;且可能通過調(diào)控bax、bc1-2和active caspa

9、se-3蛋白表達(dá)實現(xiàn)。
　　第二部分“更年春”對Aβ25-35致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　目的:研究中藥“更年春”對Aβ25-35致大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。
　　方法:取孕16-18天的SD大鼠,培養(yǎng)胎鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞。細(xì)胞分五組處理同PC12細(xì)胞,分別處理后檢測LDH釋放量以檢測細(xì)胞活性;提取細(xì)胞全蛋白,western blotting方法檢測各組細(xì)胞Bc1-2,Bax和active

10、 caspase-3的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1)與正常組比較,模型組的LDH釋放量顯著升高(p﹤0.01);而與模型組比較,MRS組的LDH釋放量顯著下降(與NGF組相當(dāng),P＜0.01)。
　　2)與正常組比較,Bax與bc1-2的表達(dá)比例,在模型組明顯升高(P＜0.01);與模型組比較,該比例在MRS組中明顯降低(P＜0.01);與bax和bc1-2的表達(dá)相對應(yīng)的,active caspase-3在MRS組