殼聚糖-藻酸鹽納米膜的制作新工藝及其促進(jìn)皮膚愈合的研究.pdf

1、背景與目的：
　　燒傷、創(chuàng)傷以及多種慢性疾病引起的潰瘍均可導(dǎo)致皮膚組織的損傷和創(chuàng)面暴露，進(jìn)而增大了細(xì)菌侵襲和全身性感染的機(jī)會(huì)。自體皮膚移植仍是目前治療皮膚損傷的常規(guī)方法。然而，對(duì)于大面積皮膚損傷（大面積燒傷）患者，由于自體皮膚大量損傷，皮源不足使靠自體皮膚移植來(lái)達(dá)到組織修復(fù)的可行性驟然降低。當(dāng)然，自體皮膚移植本身對(duì)自身正常皮膚也會(huì)造成損傷。在自體皮源不足的情況下，臨床上也經(jīng)常采用同種異體皮移植和異種皮移植來(lái)修復(fù)創(chuàng)傷皮膚組織，但宿主

2、抗移植物的天然免疫排斥反應(yīng)問(wèn)題目前仍然難以得到解決。在這種情況下，皮膚組織工程技術(shù)可發(fā)揮重要作用。具有類似皮膚組織結(jié)構(gòu)和功能的組織工程皮膚由充當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)角色的仿生生物支架材料組成，它可促進(jìn)干細(xì)胞在其表面粘附、增殖、分化，最終達(dá)到皮膚組織重建的目的。其中，細(xì)胞相容的生物多聚物超薄膜在皮膚組織工程中有著廣泛的應(yīng)用。本文研制了一種用層層自組裝(Layer-by-layer，LBL)的方法來(lái)

3、制作的超薄游離納米膜，此方法簡(jiǎn)單而安全。具體地，分別在水溶液中電離后，兩種帶相反電荷的多聚物----殼聚糖和藻酸鹽溶液在固化的明膠溶液上層層疊加，最終在明膠基底表面形成一層納米薄膜。該膜的厚度與疊加層數(shù)成正比，層與層之間的距離僅約200nm。明膠作為溫敏材料，在37℃條件下熔化后，殼聚糖/藻酸鹽納米膜可以從其表面游離制得。該方法與已有的納米膜制作方法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，它通過(guò)極其巧妙而溫和的方式獲得了與基底分離的納米膜，最大限度降

4、低了制作過(guò)程中對(duì)膜的機(jī)械損傷，從而為該膜的進(jìn)一步研究創(chuàng)造了良好的條件;其次，該方法大量縮短了納米膜制作時(shí)間，降低了納米膜制作材料成本;再次，該方法不涉及有機(jī)溶劑等毒性材料的運(yùn)用，保證了納米膜良好的生物親和力。在體外，通過(guò)在該膜上培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，可證實(shí)其能促進(jìn)細(xì)胞在其表面的粘附和增殖。在體內(nèi)，BMSCs在該納米膜上培養(yǎng)后移植到小鼠背部全層燒傷皮膚

5、表面后與單獨(dú)BMSCs注射相比具有更高的生存率和增殖能力。綜上所述，這種制作工藝提供了一種快速和便捷的制作組織工程支架材料的方法，該支架材料良好的生物相容性和游離于基底之外的特點(diǎn)也為燒傷皮膚組織修復(fù)提供了新的可能性。
　　內(nèi)容和方法：
　　1.層層自組裝法制作殼聚糖/藻酸鹽游離納米膜以固化的質(zhì)量體積比為20％的明膠溶液為基底，在室溫(20℃)條件下，將帶正電荷的殼聚糖水溶液和帶負(fù)電的藻酸鹽溶液依次在明膠基底上層層疊加，待達(dá)到

6、所要求的層數(shù)后（15層），將納米膜——明膠復(fù)合物轉(zhuǎn)入37℃去離子水中，隨著明膠基底熔化，納米膜可從其表面分離制得。
　　2.掃描電鏡(Scanning electron microscopy，SEM)和透射電鏡(Transmissionelectron microscopy，TEM)分別觀察殼聚糖/藻酸鹽納米膜結(jié)構(gòu)通過(guò)一系列適當(dāng)處理后，將殼聚糖/藻酸鹽納米膜分別置于SEM和TEM下觀察其平面結(jié)構(gòu)及層層之間的納米結(jié)構(gòu)。
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7、.殼聚糖/藻酸鹽納米膜各層水接觸角測(cè)量以明膠為基底，以上述層層自組裝法分別制作1-10層納米膜，在接觸角測(cè)量?jī)x上分別測(cè)水在各層材料上的接觸角大小。
　　4.體外細(xì)胞培養(yǎng)首先在體外將BMSCs接種到納米膜上，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，用Live/dead染色觀察3天后細(xì)胞在納米膜上的生存狀態(tài)，并以MTT染色測(cè)定細(xì)胞在納米膜上和在空白96孔板中的生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行對(duì)比。
　　5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)制作小鼠背部全層皮膚缺損模型，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

8、實(shí)驗(yàn)組予殼聚糖/藻酸鹽納米膜移植到創(chuàng)面上，對(duì)照組創(chuàng)面不予納米膜覆蓋。分別接種綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)基因標(biāo)記的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(GFP-BMSCs)后，用小動(dòng)物成像儀觀察不同時(shí)間點(diǎn)小鼠創(chuàng)面綠色熒光密度和強(qiáng)度，用流式細(xì)胞儀(Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)檢測(cè)創(chuàng)面組織中陽(yáng)性GFP-BMSCs百分比，觀察各組小鼠創(chuàng)面在不同時(shí)間點(diǎn)愈合情況，

9、組織冰凍切片觀察創(chuàng)面新生組織中GFP-BMSCs生長(zhǎng)情況，并對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行組織切片染色觀察創(chuàng)面上皮化情況。
　　結(jié)果：
　　1.層層自組裝殼聚糖/藻酸鹽納米膜是一種三維仿生膜，每?jī)蓪又g的間距僅200nm，膜的總厚度與層數(shù)成正比;層層自組裝是一種成功的制作方法，每組裝一層，膜的結(jié)構(gòu)也相應(yīng)發(fā)生變化，由于各層間材料親水性不同，與水的接觸角大小也相應(yīng)發(fā)生變化。
　　2.體外BMSCs在納米膜上培養(yǎng)3天后，通過(guò)細(xì)胞活死染色分析，B

10、MSCs的存活率高于99％，并可見大量正處于分裂期的細(xì)胞，證實(shí)了納米膜良好的生物相容性。細(xì)胞分別在納米膜上培養(yǎng)和在空白96孔板中培養(yǎng)后，經(jīng)過(guò)MTT染色測(cè)量其相對(duì)濃度，72h后納米膜上細(xì)胞相對(duì)濃度顯著高于96孔板中細(xì)胞相對(duì)濃度，P＜0.05。
　　3.背部創(chuàng)面予以殼聚糖/藻酸鹽超薄納米膜覆蓋組（實(shí)驗(yàn)組）與未予納米膜覆蓋組（對(duì)照組）比較，在小動(dòng)物活體成像儀上可見實(shí)驗(yàn)組小鼠創(chuàng)面綠色熒光面積更大，信號(hào)強(qiáng)度更強(qiáng)。根據(jù)熒光定量檢測(cè)結(jié)果，術(shù)后7

11、d實(shí)驗(yàn)組GFP信號(hào)強(qiáng)度為25.97±6.98(×104)，對(duì)照組為6.00±2.84(×104)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)結(jié)果:術(shù)后5d，實(shí)驗(yàn)組平均陽(yáng)性GFP-MSC百分比(66.78％±7.00％)明顯高于對(duì)照組(33.58％±3.62％)，P＜0.05;術(shù)后7d，實(shí)驗(yàn)組平均陽(yáng)性GFP-MSC百分比(53.63％±3.64％)明顯高于對(duì)照組(33.45％±8.76％)，P＜0.05。同組兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)之間的差

12、別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.術(shù)后小鼠創(chuàng)面愈合情況:在術(shù)后第1、3、5、7、9天分別觀察各組小鼠創(chuàng)面愈合情況，并計(jì)算統(tǒng)計(jì)殘余創(chuàng)面所占原創(chuàng)面的百分比。結(jié)果顯示:各組小鼠創(chuàng)面大小均隨時(shí)間逐漸減小，納米膜+BMSCs注射組創(chuàng)面隨著時(shí)間延長(zhǎng)（術(shù)后第7、9天）在同一時(shí)間點(diǎn)愈合情況優(yōu)于空白對(duì)照組、納米膜組和BMSCs注射組，空白對(duì)照組愈合情況最差;術(shù)后9天納米膜+BMSCs注射組小鼠創(chuàng)面已接近完全愈合，殘余創(chuàng)面百分比小于其它3組，P＜0.05。<

13、br>　　6.術(shù)后14d取小鼠背部創(chuàng)面新生成組織制作冰凍切片，鏡下觀察結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組新生組織中GFP-MSC數(shù)量及密度均明顯高于對(duì)照組，隨機(jī)選取鏡下同樣大小視野(800μm×600μm)對(duì)綠色熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組為101.00±15.51個(gè)/視野，對(duì)照組為25.25±5.07個(gè)/視野，實(shí)驗(yàn)組熒光細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，P＜0.05。
　　7.術(shù)后3d和7d取小鼠背部創(chuàng)面進(jìn)行組織切片HE染色，觀察各組小鼠創(chuàng)面上皮化情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。術(shù)

14、后3d各組創(chuàng)面上皮化無(wú)明顯差異;術(shù)后7d納米膜+BMSCs注射組新生上皮平均長(zhǎng)度(1099.8μm)顯著高于納米膜組(764.4μm，P＜0.05)、BMSCs注射組(837.3μm，P＜0.05)和空白對(duì)照組(533.1μm，P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　以溫敏材料明膠為基底，利用層層自組裝法制作殼聚糖/藻酸鹽超薄游離納米膜的新制作工藝與其它納米膜制作方法相比，減少了制作過(guò)程中對(duì)膜的機(jī)械損傷，并大量縮短了納米膜制作時(shí)間