殼聚糖-藻酸鹽支架復合BMSCs修復脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、背景：脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是骨科領域的常見創(chuàng)傷，通常導致嚴重的神經(jīng)功能障礙和殘疾，不僅影響個人生理和心理健康，同時對家庭和社會造成嚴重負擔。隨著交通、工礦、體育及建筑業(yè)的日益發(fā)達，其發(fā)生率有逐年上升的趨勢。2004年，美國脊髓損傷統(tǒng)計中心報告：美國每年就有超過11000例新發(fā)病例，全世界SCI每年發(fā)生率是15～40例/百萬。
　　 脊髓損傷以往被認為是不可能治愈的疾病，長期以來人們對SCI后截

2、癱治療一直持悲觀態(tài)度，近年來有關SCI的基礎研究的發(fā)展，加深了對脊髓損傷后，脊髓再生修復相關因素的認識。分子生物學，細胞生物學等學科的發(fā)展為SCI的治療提供了新的手段，為人類SCI的成功治療帶來了新的希望，并不斷有新的脊髓損傷后的治療方法應用到臨床實驗，如周圍神經(jīng)移植、胚胎脊髓移植、神經(jīng)干細胞移植、骨髓間充質(zhì)干細胞、嗅鞘細胞移植及多種藥物的實驗性治療等，但到目前為止，國內(nèi)外治療脊髓損傷的各種方案均未取得滿意的臨床療效，世界各國均把脊髓損

3、傷后，如何促進脊髓的再生與功能恢復作為一項難題與研究重點。
　　 脊髓組織工程技術的興起為脊髓損傷后脊髓的修復與功能恢復帶來了新的希望，它是將體外培養(yǎng)的種子細胞種植于生物相容性良好、可在體內(nèi)逐步降解的支架材料中，通過構建見組織工程化脊髓修復脊髓損傷。而作為組織工程三要素“種子細胞、支架材料與合適的細胞營養(yǎng)因子”的選擇是利用組織工程技術修復組織損傷的重要問題。
　　 本研究以骨髓間充質(zhì)干細胞為種子細胞(bone marro

4、w mesenchymal stemcells，BMSCs)，選取天然可降解生物材料：殼聚糖、藻酸鹽，將兩者通過紫外線照射交聯(lián)、低壓冷凍干燥法制備多通道支架材料，將BMSCs種植于復合支架中構建組織工程化脊髓，探討其對脊髓損傷的修復作用，以其發(fā)現(xiàn)一種脊髓損傷后新的治療方法。
　　 目的：研究殼聚糖-藻酸鹽支架復合骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)構建組織工程脊髓，橋

5、接大鼠脊髓半橫斷損傷斷端，促進急性脊髓損傷(spinal cord iniury，SCI)修復的作用。
　　 方法：取1只成年雄性SD大鼠骨髓，分離、培養(yǎng)BMSCs。采用冷凍干燥法制備殼聚糖-藻酸鹽支架，掃描電鏡觀察結構，用浸提液實驗檢測毒性。將支架材料與第2代BMSCs以細胞密度1×106個/mL體外復合培養(yǎng)制備組織工程脊髓，于培養(yǎng)后1、3、5d掃描電鏡觀察其生物相容性。取成年雌性SD大鼠40只制備急性脊髓T9半橫斷損傷模型，

6、根據(jù)修復方法不同隨機將大鼠分為4組(n=10)。A組于損傷區(qū)植入組織工程脊髓，B組植入單純支架，C組植入20μL1×107個/mL BMSCs，D組直接縫合硬膜作為空白對照。術后1、2、4、6周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分評價大鼠后肢運動功能；術后6周取材行麥芽凝集素-辣根過氧化物酶(wheat germagglutinin-horseradish peroxidase，WGA-HRP)神經(jīng)逆行示蹤檢

7、測、HE染色和免疫熒光染色檢測。
　　 結果：掃描電鏡觀察示殼聚糖-藻酸鹽支架呈三維多孔海綿樣結構。浸提液實驗顯示支架材料的細胞毒性等級為0～1級。掃描電鏡觀察示BMSCs與支架材料復合培養(yǎng)3d后即可黏附于支架材料表面，細胞呈一定方向排列。術后2、4、6周A組BBB評分均明顯高于其余各組，D組明顯低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；B組術后4、6周高于C組(P＜0.05)。術后6周，各組WGA-HRP神經(jīng)逆行示蹤檢

8、測示陽性神經(jīng)纖維均未能穿過脊髓斷端。HE染色與免疫熒光染色顯示A組宿主脊髓與組織工程脊髓連接緊密，損傷區(qū)內(nèi)無明顯瘢痕組織長入，有較多神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament200，NF-200)陽性細胞發(fā)生的神經(jīng)纖維及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)陽性神經(jīng)元樣細胞；B組支架植入外周可見成纖維細胞形成的瘢痕組織以及少量侵入尚未降解的支架材料；交界區(qū)可見少量NSE、NF-200陽性細胞；C