殼聚糖-藻酸鹽支架復(fù)合BMSCs修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是骨科領(lǐng)域的常見創(chuàng)傷，通常導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙和殘疾，不僅影響個(gè)人生理和心理健康，同時(shí)對(duì)家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。隨著交通、工礦、體育及建筑業(yè)的日益發(fā)達(dá)，其發(fā)生率有逐年上升的趨勢(shì)。2004年，美國(guó)脊髓損傷統(tǒng)計(jì)中心報(bào)告：美國(guó)每年就有超過11000例新發(fā)病例，全世界SCI每年發(fā)生率是15～40例/百萬(wàn)。
　　 脊髓損傷以往被認(rèn)為是不可能治愈的疾病，長(zhǎng)期以來人們對(duì)SCI后截

2、癱治療一直持悲觀態(tài)度，近年來有關(guān)SCI的基礎(chǔ)研究的發(fā)展，加深了對(duì)脊髓損傷后，脊髓再生修復(fù)相關(guān)因素的認(rèn)識(shí)。分子生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展為SCI的治療提供了新的手段，為人類SCI的成功治療帶來了新的希望，并不斷有新的脊髓損傷后的治療方法應(yīng)用到臨床實(shí)驗(yàn)，如周圍神經(jīng)移植、胚胎脊髓移植、神經(jīng)干細(xì)胞移植、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞移植及多種藥物的實(shí)驗(yàn)性治療等，但到目前為止，國(guó)內(nèi)外治療脊髓損傷的各種方案均未取得滿意的臨床療效，世界各國(guó)均把脊髓損

3、傷后，如何促進(jìn)脊髓的再生與功能恢復(fù)作為一項(xiàng)難題與研究重點(diǎn)。
　　 脊髓組織工程技術(shù)的興起為脊髓損傷后脊髓的修復(fù)與功能恢復(fù)帶來了新的希望，它是將體外培養(yǎng)的種子細(xì)胞種植于生物相容性良好、可在體內(nèi)逐步降解的支架材料中，通過構(gòu)建見組織工程化脊髓修復(fù)脊髓損傷。而作為組織工程三要素“種子細(xì)胞、支架材料與合適的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子”的選擇是利用組織工程技術(shù)修復(fù)組織損傷的重要問題。
　　 本研究以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞(bone marro

4、w mesenchymal stemcells，BMSCs)，選取天然可降解生物材料：殼聚糖、藻酸鹽，將兩者通過紫外線照射交聯(lián)、低壓冷凍干燥法制備多通道支架材料，將BMSCs種植于復(fù)合支架中構(gòu)建組織工程化脊髓，探討其對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用，以其發(fā)現(xiàn)一種脊髓損傷后新的治療方法。
　　 目的：研究殼聚糖-藻酸鹽支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)構(gòu)建組織工程脊髓，橋

5、接大鼠脊髓半橫斷損傷斷端，促進(jìn)急性脊髓損傷(spinal cord iniury，SCI)修復(fù)的作用。
　　 方法：取1只成年雄性SD大鼠骨髓，分離、培養(yǎng)BMSCs。采用冷凍干燥法制備殼聚糖-藻酸鹽支架，掃描電鏡觀察結(jié)構(gòu)，用浸提液實(shí)驗(yàn)檢測(cè)毒性。將支架材料與第2代BMSCs以細(xì)胞密度1×106個(gè)/mL體外復(fù)合培養(yǎng)制備組織工程脊髓，于培養(yǎng)后1、3、5d掃描電鏡觀察其生物相容性。取成年雌性SD大鼠40只制備急性脊髓T9半橫斷損傷模型，

6、根據(jù)修復(fù)方法不同隨機(jī)將大鼠分為4組(n=10)。A組于損傷區(qū)植入組織工程脊髓，B組植入單純支架，C組植入20μL1×107個(gè)/mL BMSCs，D組直接縫合硬膜作為空白對(duì)照。術(shù)后1、2、4、6周采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能；術(shù)后6周取材行麥芽凝集素-辣根過氧化物酶(wheat germagglutinin-horseradish peroxidase，WGA-HRP)神經(jīng)逆行示蹤檢

7、測(cè)、HE染色和免疫熒光染色檢測(cè)。
　　 結(jié)果：掃描電鏡觀察示殼聚糖-藻酸鹽支架呈三維多孔海綿樣結(jié)構(gòu)。浸提液實(shí)驗(yàn)顯示支架材料的細(xì)胞毒性等級(jí)為0～1級(jí)。掃描電鏡觀察示BMSCs與支架材料復(fù)合培養(yǎng)3d后即可黏附于支架材料表面，細(xì)胞呈一定方向排列。術(shù)后2、4、6周A組BBB評(píng)分均明顯高于其余各組，D組明顯低于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；B組術(shù)后4、6周高于C組(P＜0.05)。術(shù)后6周，各組WGA-HRP神經(jīng)逆行示蹤檢

8、測(cè)示陽(yáng)性神經(jīng)纖維均未能穿過脊髓斷端。HE染色與免疫熒光染色顯示A組宿主脊髓與組織工程脊髓連接緊密，損傷區(qū)內(nèi)無(wú)明顯瘢痕組織長(zhǎng)入，有較多神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament200，NF-200)陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生的神經(jīng)纖維及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)陽(yáng)性神經(jīng)元樣細(xì)胞；B組支架植入外周可見成纖維細(xì)胞形成的瘢痕組織以及少量侵入尚未降解的支架材料；交界區(qū)可見少量NSE、NF-200陽(yáng)性細(xì)胞；C