B細(xì)胞活化因子與炎癥性腸病的相關(guān)性研究.pdf

1、背景和目的：
　　炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種病因尚不明確的腸道慢性炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn's disease，CD）。IBD的發(fā)病率近年來(lái)一直呈上升趨勢(shì)，其病程遷延反復(fù)，難以徹底治愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量甚至威脅患者的生命健康。目前IBD的診斷主要基于臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡、組織學(xué)、放射學(xué)以及基因檢測(cè)等資料，侵

2、入性及昂貴的檢查手段常給患者帶來(lái)身心負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，IBD相關(guān)的生物標(biāo)記物檢測(cè)因無(wú)創(chuàng)、操作簡(jiǎn)單、易被患者接受等特點(diǎn)而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。尋找有效的生物標(biāo)記物，為IBD的早期診斷、有效治療及疾病進(jìn)展評(píng)估提供更準(zhǔn)確的依據(jù)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。
　　在發(fā)病機(jī)制上目前認(rèn)為 IBD是感染、環(huán)境等因素觸發(fā)了遺傳易感個(gè)體異常的腸道粘膜免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腸道持續(xù)的炎癥和組織損傷。研究證實(shí)CD4+Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群失衡與 IBD的

3、發(fā)生密切相關(guān)。此外，IBD中存在針對(duì)腸道正常菌群及自身抗原失去免疫耐受，產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生自身抗體，介導(dǎo)組織損傷。異常活化和分化的B細(xì)胞在這一過(guò)程中可能發(fā)揮重要的作用，進(jìn)而參與IBD的發(fā)生發(fā)展。
　　B細(xì)胞活化因子（B cell activating factor，BAFF)是腫瘤壞死因子超家族（tumor necrosis factor super family, TNFSF）的成員之一，是B細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟和穩(wěn)定的重

4、要調(diào)節(jié)因子。BAFF通過(guò)與其受體結(jié)合，提供B細(xì)胞生存信號(hào)，促進(jìn)生發(fā)中心形成和抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換。BAFF的過(guò)表達(dá)時(shí)則可刺激外周B細(xì)胞增殖分化，使自身反應(yīng)性 B細(xì)胞逃逸凋亡信號(hào),促進(jìn)漿細(xì)胞的存活,導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受狀態(tài)的破壞。除了是 B細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,BAFF在T細(xì)胞共刺激方面亦發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道BAFF在多種慢性炎癥性疾病中表達(dá)異常增多，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等，并且部分患者病情和血清BAFF水平相關(guān)。然而B(niǎo)AFF

5、在IBD中的表達(dá)情況尚不明確。
　　在本研究中，我們?cè)噲D分析BAFF及其受體在IBD不同組群中的表達(dá)差異及其與臨床特征的相關(guān)性，探索BAFF作為IBD生物標(biāo)記物的潛在臨床價(jià)值，深化我們對(duì)BAFF在IBD發(fā)病機(jī)制中作用和地位的認(rèn)識(shí)，為IBD的臨床治療提供一定的思路和理論依據(jù)。
　　方法
　　1.收集明確診斷為UC的患者78例、CD患者37例，腸易激綜合征患者12例，健康對(duì)照44人，采集外周靜脈血、腸道活檢標(biāo)本（IBD患者

6、腸道標(biāo)本包括炎癥部位和非炎癥部位）和糞便標(biāo)本。ELISA法檢測(cè)血清及糞便 BAFF的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot和免疫熒光法檢測(cè)腸道組織BAFF的基因和蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用Bio-plex高通量平臺(tái)測(cè)定血清炎癥細(xì)胞因子的含量。
　　2.建立葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型。C57BL/6小鼠16只，隨機(jī)分為慢性腸炎組（n=8）：小鼠自由飲用3％ DSS溶液7天，然后改為飲用正常水10天，此為一個(gè)周期，共4個(gè)周

7、期；正常對(duì)照組(n=8)：自由飲相應(yīng)天數(shù)正常水。每天記錄小鼠的體重、糞便、活動(dòng)和精神狀態(tài)等一般情況，通過(guò)疾病活動(dòng)評(píng)分、結(jié)腸組織大體形態(tài)、結(jié)腸長(zhǎng)度及組織病理學(xué)評(píng)分進(jìn)行模型評(píng)價(jià)。
　　3.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot和免疫熒光法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織BAFF的基因和蛋白表達(dá)水平。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中BAFF三種受體（BCMA、TACI、BAFF-R)的mRNA表達(dá)。免疫熒光法檢測(cè)小鼠腸道組織B細(xì)胞數(shù)量改變。

8、ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清和腸道粘液中IgA、IgG抗體的含量。
　　結(jié)果
　　1.數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。CD患者血清 BAFF水平為1430（1105-1624) pg/ml, UC組為1472(1018-1772) pg/ml，均較正常對(duì)照組（977(482-1345) pg/ml）顯著升高（P值分別為0.005和0.007）。活動(dòng)期患者的血清BAFF水平較非活動(dòng)期患者和正常對(duì)照組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

9、P值分別為0.046和0.001)。
　　2. UC患者血清BAFF水平與Mayo評(píng)分存在相關(guān)性(r=O．425，P=0．017)，且血清BAFF與hsCRP、TNF-α、IL-1β均顯著相關(guān)(r值分別為O．745、O．810、O．829，P值分別為＜0.001、0．015、0．042)。
　　3.受試者工作特征曲線（ROC）分析血清BAFF最佳截?cái)嘀禐?414 pg/mL，敏感性和特異性分別為64%和93%，曲線下面積（A

10、UC）為0.797（95%可信區(qū)間：0.654-0.940）。
　　4.與健康組比較，BAFF在UC和CD患者結(jié)腸組織中表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果：P值分別為0.003和0.045，Westernblot結(jié)果：P值分別為0.005和0.028)，免疫熒光結(jié)果顯示BAFF在腸道固有層有表達(dá)，且表達(dá)明顯增加。
　　5. CD患者糞便BAFF水平為369(326-493) pg/ml,UC組為542(358-

11、1758) pg/ml，均較IBS組（294(287-299) pg/ml）和正常對(duì)照組（295(284-309) pg/ml）顯著增加（P值均＜0.001）?；顒?dòng)期UC患者的糞便BAFF水平高于非活動(dòng)期UC組，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)。非活動(dòng)期IBD患者的糞便BAFF水平顯著高于IBS和正常對(duì)照(P＜0.01)。
　　6. ROC曲線分析糞便BAFF最佳截?cái)嘀禐?25pg/mL，敏感性和特異性分別為90%和96

12、%，AUC為0.936（95%可信區(qū)間：0.868-1）。
　　7.成功建立結(jié)腸炎模型，與對(duì)照組比較，DSS組小鼠結(jié)腸中 BAFF的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果：P=0．033，Western blot結(jié)果：P=O．024)；其受體BCMA mRNA水平較正常對(duì)照組增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04），而TACI和BAFF-R的表達(dá)無(wú)明顯改變（P＞0.05）。
　　8. DSS模型組結(jié)腸B細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明

13、顯增加；血清IgA、IgG抗體水平顯著升高（P值分別為0.019和0.028）；腸道粘液IgA、IgG水平升高，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.03和0.012）。
　　結(jié)論
　　BAFF在IBD患者血清、結(jié)腸組織及糞便中表達(dá)增加，可能參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。血清BAFF與UC疾病活動(dòng)度相關(guān)，具有評(píng)估患者疾病嚴(yán)重程度的潛能。糞便BAFF是較為理想的IBD生物學(xué)標(biāo)志物，其診斷效能優(yōu)于血清BAFF。DSS介導(dǎo)的慢性