二化螟B(niǎo)t毒素受體蛋白—氨肽酶N和鈣粘蛋白基因的克隆及在昆蟲(chóng)細(xì)胞系的表達(dá).pdf

1、二化螟Chilo suppressalis(Walker)是嚴(yán)重威脅我國(guó)水稻生產(chǎn)的重要害蟲(chóng).近年米,受耕作制度和種植結(jié)構(gòu)的改變、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻品種的大面積種植、天氣等原因的影響,二化螟的發(fā)生逐年加重,而且由于化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期大量反復(fù)的使用,使其抗藥性明顯上升,更加難以防治.轉(zhuǎn)Bt基因水稻的出現(xiàn)為防治二化螟提供了新的有效的方法,但是從生物學(xué)角度來(lái)看,昆蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性是一種脅迫進(jìn)化現(xiàn)象.因此,研究Bt毒殺二化螟的機(jī)理、二化螟對(duì)Bt產(chǎn)生抗性

2、的可能機(jī)制,可以為將來(lái)轉(zhuǎn)基因水稻的推廣、制定抗性治理策略、延長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因水稻的使用期限等提供重要的理論依據(jù). 本文研究了二化螟B(niǎo)t毒素的主要受體一氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN)和鈣粘蛋白(Cadherin CAD),利用PCR結(jié)合RACE技術(shù)的方法得到了二化螟中腸APN和鈣粘蛋白基因的全長(zhǎng)序列,并在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中成功地進(jìn)行了表達(dá). 1.利用PCR結(jié)合RACE技術(shù)的方法得到了二化螟中腸氨基氨肽酶N基

3、因的全長(zhǎng)序列,同時(shí)利用PCR技術(shù)得到鈣粘蛋白基因的全長(zhǎng)序列.其中APN經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定為氨肽酶N基因家族的1個(gè)成員,其基因全長(zhǎng)已在GENEBANK登記,登錄的序列號(hào)為:DQ342305,基因全長(zhǎng)3292bp,編碼1075個(gè)氨基酸,其C端有一段25個(gè)氨基酸組成的片段,具有親脂性和跨膜特性;鈣粘蛋白基因在GENEBANK登錄的序列號(hào)為:DQ821523,基因全長(zhǎng)5148bp,編碼1715個(gè)氨基酸,有16個(gè)鈣粘蛋白重復(fù)域,與歐洲玉米螟等其他鱗

4、翅目昆蟲(chóng)鈣粘蛋白具有較高的同源性,同源性達(dá)73﹪. 2.昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為四大表達(dá)系統(tǒng)之一,已廣泛應(yīng)用于重組蛋白的表達(dá).該系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn),如多角體啟動(dòng)子控制下的高效表達(dá),比較完善的轉(zhuǎn)錄后加工修飾,容易從細(xì)胞中純化,無(wú)內(nèi)毒素污染等.將APN和鈣粘蛋白的基因克隆到Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)中桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacI{Tb中多角體基因啟動(dòng)子的下游,篩選出重組質(zhì)粒pFastBacHTb/目的基因;并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1