棉鈴蟲氨肽酶N(Haapn1)和鈣粘蛋白(Ha_BtR)基因的RNA干擾及對Cry1Ac毒力的影響.pdf

1、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera Hübner)是一種重要的世界性棉花害蟲。自轉(zhuǎn)Bt基因棉花大面積種植以來，棉鈴蟲得到了有效的控制，并且減少了化學農(nóng)藥的使用。在Bt棉花長期選擇壓力下，棉鈴蟲對Bt棉花的抗性風險問題不容回避。棉鈴蟲氨肽酶N(Haapnl)和鈣粘蛋白(Ha_BtR)是Bt毒素Cry1Ac作用過程中的兩個重要受體，Haapnl以及Ha_BtR基因突變都能使棉鈴蟲對Cry1Ac產(chǎn)生抗性。本文將Haapnl和Ha

2、_BtR基因的一段雙鏈RNA注射到棉鈴蟲四齡幼蟲體內(nèi)，測定單個基因或兩個基因沉默后對Cry1Ac活化毒素和原毒素毒力的影響，以期探明棉鈴蟲Haapnl和HaBtR這兩個受體在Bt毒素Cry1Ac毒殺過程中的相互作用，有助于對Bt毒素作用機理和抗性機理進行更全面的認識。
　　 1.氨肽酶N(Haapnl)和鈣粘蛋白（Ha_BtR）dsRNA注射劑量的確定
　　 通過RT-PCR擴增出Haapnl和Ha_BtR基因片段，并以

3、此作為模板合成dsRNA。用微量進樣器將雙鏈RNA導入到4齡幼蟲淋巴液中，分別注射Haapnl、Ha_BtRdsRNA1μg、3μg、6μg和12μg，注射ES緩沖液(elution solution)作為對照。48小時后實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，注射1μg Haapnl dsRNA后，mRNA表達量下降為對照的49％;注射1μg Ha_BtR dsRNA后，表達量下降為對照的70％。注射1μg dsRNA劑量的基因沉默效率高于其

4、他劑量，因此確定1μg dsRNA為本研究采用的注射劑量。
　　 2.Haapnl和Ha BtR單個基因被干擾后對Cry1Ac毒力的影響
　　 在棉鈴蟲敏感品系(SCD)中，Cry1Ac活化毒素對注射HaapnldsRNA幼蟲的毒力顯著低于對注射ES幼蟲的毒力；而Cry1Ac原毒素對注射HaapnldsRNA幼蟲與注射ES幼蟲的毒力無顯著差異。Cry1Ac活化毒素以及原毒素對注射Ha_BtRdsRNA幼蟲與注射ES幼蟲的

5、毒力均無顯著差異。
　　 在敏感品系SCD與鈣粘蛋白突變品系SCD-r1雜交后代(F1)中分別沉默Haapnl和HaBtR基因，以研究在Ha_BtR低表達的條件下其對Cry1Ac毒力的影響。Cry1Ac活化毒素對注射Haapnl dsRNA幼蟲的死亡率低于注射ES幼蟲的死亡率（差異極顯著），而原毒素對注射Haapnl dsRNA和ES的幼蟲的毒力無顯著差異。注射Ha_BtRdsRNA幼蟲對Cry1Ac活化毒素（在第四天和第五天）

6、及原毒素（在第三天和第四天）的敏感性顯著低于注射ES的幼蟲。
　　 3.Haapnl和Ha_BtR兩個基因同時被干擾后對Cry1Ac毒力的影響
　　 在SCD品系幼蟲中注射Haapnl和Ha_BtRdsRNA混合液（各1μg）后，HaapnlmRNA和Ha_BtR mRNA表達量分別下降為對照的54％和63％。干擾后的幼蟲對Cry1Ac活化毒素和原毒素的敏感性均顯著下降，在第五天的差異達到極顯著。
　　 在F1幼

7、蟲中注射Haapnl和HaBtRdsRNA混合液（各1μg）后，兩個基因的表達量分別下降為對照的67％和36％。Cry1Ac活化毒素對干擾后的幼蟲的毒力（在第4天和第5天）低于對注射ES幼蟲的毒力（差異極顯著）；Cry1Ac原毒素對干擾后幼蟲的死亡率也低于對照組的死亡率（在第5天差異極顯著）。
　　 因此，棉鈴蟲幼蟲Haapnl表達量下降能夠使Cry1Ac毒力顯著下降，Ha_BtR表達量下降對Cry1Ac毒力的影響有限；與單個基