Nud C基因的克隆、表達及其蛋白在鼻咽癌細胞系中的作用.pdf

1、細胞核遷移(nuclearmigration)是一種細胞核向細胞中特定位點移動的非隨機現(xiàn)象，對于生長分裂以及發(fā)育等正常的細胞活動都是至關(guān)重要的，并且普遍存在于從酵母到哺乳動物的許多真核生物中。核遷移蛋白C(nucleardistributionC，NudC)在核遷移中起著重要作用。NudC與其家族成員(包括胞質(zhì)動力蛋白，肌動蛋白，LIS1和NudE)相互作用，和微管一起參與細胞增殖、神經(jīng)遷移和腦發(fā)育。 微管在多種細胞功能中起著關(guān)

2、鍵作用，以微管動力蛋白為靶點，在有絲分裂過程中阻抑微管功能的抗腫瘤藥物，例如紫杉醇、秋水仙素、長春花堿等在治療腫瘤方面已經(jīng)顯示出它的重要性，已被廣泛應(yīng)用并取得了較好的療效。但是受藥物自身性質(zhì)的影響，臨床使用中逐漸暴露出來一些亟待解決的問題。例如，腫瘤細胞的耐藥性、較差的水溶性和毒副作用等。 在人類，己證明NUDC的表達是被高度調(diào)控的，它的表達水平與各種細胞類型、增殖狀態(tài)有關(guān)，不同分裂能力的細胞呈現(xiàn)出不同水平的NUDC表達。正在分

3、裂的細胞中可以觀察到NUDC強烈的免疫標記，NudC的mRNA水平在細胞周期的G1中期增加，NudC的蛋白水平在細胞周期的G2/M期增加了2倍，在生長速率高的哺乳動物細胞中NudC的表達水平也是升高的。這些研究顯示NUDC的水平與癌細胞的增殖過程有密切的關(guān)系。因此這使NUDC很可能成為檢測腫瘤發(fā)生的一項指標。 頭頸部惡性腫瘤中，鼻咽癌在廣東地區(qū)的發(fā)病率為30-50/10萬人口，俗稱“廣東癌”。目前鼻咽癌治療方法以放療、化療和手術(shù)

4、為主，但對晚期、復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移的患者療效不理想。鼻咽癌是一種增殖失控的疾病，而細胞增殖是通過細胞周期實現(xiàn)的，其中有絲分裂和胞質(zhì)分裂是細胞周期中的重要階段。由于NUDC是完成有絲分裂所必需的蛋白，因此我們設(shè)想尋找特異性的小分子抑制劑來阻滯NUDC表達，使分裂增殖旺盛的鼻咽癌細胞停滯在有絲分裂期，從而NUDC很可能具有抑制腫瘤的活性，并成為腫瘤治療的新靶標。 因此，本論文首先使用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)對NudC基因進行克隆、表達和純化

5、。使用PCR方法，以質(zhì)粒pB42AD-NudC為模板，擴增人NudC全長cDNA，限制性酶內(nèi)切酶BamHI、XhoI及T4連接酶將NudC基因克隆于pET-28b構(gòu)建重組表達載體，篩選陽性克隆后，經(jīng)酶切和測序鑒定后，在大腸桿菌中BL21(DE3)中進行原核表達重組NUDC蛋白，并利用蛋白N'端的6個氨基酸尾確立了一套穩(wěn)定、有效的重組蛋白NUDC的純化工藝。利用金屬親和層析和DEAE陰離子交換層析，對表達后以水溶性形式存在的重組蛋白NUD

6、C進行純化。結(jié)果顯示：經(jīng)陽性篩選及測序分析，NudC基因全長cDNA成功克隆到質(zhì)粒pET-28b，pET-28b-NudC可在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達NUDC融合蛋白，并通過親和層析及過柱獲得高純度的NUDC蛋白。 將純化的NUDC蛋白多次多點免疫新西蘭白兔，制備抗NUDC蛋白多克隆抗體，通過瓊脂雙向擴散實驗初步檢測其免疫原性，通過ELISA確定多克隆抗體免疫效價，SDS-PAGE檢測其純度，WesternBlot鑒

7、定抗體蛋白特性。試驗結(jié)果表明成功制備和純化了抗NUDC蛋白多克隆抗體，多克隆抗體免疫效價達到1∶25600，SDS-PAGE檢測其純度達到90％。 本論文首次使用間接免疫熒光染色法檢測了NUDC在鼻咽癌細胞系CNE-2、HNE-2中的亞細胞定位。以抗NUDC蛋白多克隆抗體作為一抗，以經(jīng)過FITC免疫熒光標記的羊抗兔IgG抗體作為二抗，并使用DAPI熒光染料特異地標記細胞核，將NUDC蛋白標記為綠色熒光，細胞核標記為藍色熒光。結(jié)果

8、發(fā)現(xiàn)NUDC蛋白在鼻咽癌細胞中表達主要位于細胞質(zhì)核區(qū)附近，細胞核也可見少量表達。而NUDC蛋白在作為對照的人成纖維細胞NIH-3T3中的表達量相對較少。 同時，以鼻咽癌細胞細胞系CNE-2、HNE-2作為研究對象，鼻咽非癌性組織作為對照，裂解分離細胞和組織蛋白后，通過SDS-PAGE蛋白電泳和WesternBlot方法，在蛋白水平檢測了NUDC蛋白在鼻咽癌細胞CNE-2、HNE-2和鼻咽非癌性組織中的表達情況。結(jié)果證明在鼻咽癌細

9、胞CNE-2、HNE-2均有NUDC蛋白表達，且其在鼻咽癌細胞中的表達量明顯高于鼻咽非癌性組織。 為了進一步探索鼻咽癌新的治療方法，本論文還使用MTT方法初步探討了NUDC抗體對鼻咽癌細胞活性的影響。通過向培養(yǎng)的鼻咽癌細胞CNE-2、HNE-2中加入不同濃度的NUDC抗體溶液共培養(yǎng)一定時間后，觀察鼻咽癌細胞CNE-2、HNE-2的細胞活性。結(jié)果證明鼻咽癌細胞的生長活性隨著培養(yǎng)液中抗NUDC蛋白的抗體濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢，且存在著

10、劑量-反應(yīng)關(guān)系。 綜上所述，本論文成功地克隆、表達和純化了NUDC蛋白，并成功制備其多克隆抗體，證明了NUDC蛋白在鼻咽癌細胞中的表達和分布情況，創(chuàng)新性地證明了NUDC蛋白在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并且抗NUDC蛋白抗體可在體外明顯地抑制鼻咽癌細胞CNE-2、HNE-2的生長。這為進一步研究NudC在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的分子作用機制提供了一定的理論依據(jù)，也為開發(fā)治療鼻咽癌的新型制劑打下了良好的工作基礎(chǔ)，這很有可能為鼻