馬鈴薯晚疫病水平抗性相關(guān)基因StPRp27和POTHR-1的功能分析.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是世界上第四大糧食作物,在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的病害,在世界各地頻繁發(fā)生。馬鈴薯對晚疫病的抗性分為垂直抗性和水平抗性,由于晚疫病原菌小種變異迅速,容易產(chǎn)生新的強(qiáng)致病力生理小種,從而由主效基因控制的垂直抗性不持久。而由多基因控制的水平抗性,屬于非小種?；剐?對不同的晚疫病生理小種都具有抗性,

2、抗性較為持久、穩(wěn)定。目前,研究人員已開展了與水平抗性相關(guān)QTL位點的定位以及差異表達(dá)基因分離、鑒定等工作,初步揭示了參與水平抗性的相關(guān)基因,并對這些基因在晚疫病菌侵染期間的表達(dá)模式以及參與的防衛(wèi)代謝途徑進(jìn)行了研究。
　　 在晚疫病菌誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)基因中,病程相關(guān)蛋白基因StPRp27基因和一個與過敏反應(yīng)相關(guān)的POTHR-1基因,在受到機(jī)械傷害、滲透脅迫、以及茉莉酸等處理時,均可被誘導(dǎo)表達(dá)。因此推斷這兩個基因參與了馬鈴薯晚疫病的防

3、御反應(yīng),但作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過功能分析探索其在抗性途徑中的作用,取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1、在本氏煙草上瞬時超量表達(dá)StPRp27和POTHR-1,同時設(shè)置陽性對照Rpi-R3a(對晚疫病生理小種99189表現(xiàn)垂直抗性)和Rpi-sto(對晚疫病生理小種PY23表現(xiàn)為垂直抗性),陰性對照為對這兩個晚疫病生理小種均無抗性的R基因(abpt)。對瞬時超量表達(dá)以上基因的葉片接種晚疫病進(jìn)行抗性鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)StP

4、Rp27和POTHR-1的葉片對不同的晚疫病生理小種的抗性均有一定的提高,初步證明StPRp27和POTHR-1基因與晚疫病抗性有關(guān)。
　　 2、以含有R基因(Rpi-blb1或Rpi-blb2)的轉(zhuǎn)基因本氏煙草和馬鈴薯野生種為宿主材料,利用病毒介導(dǎo)的基因沉默體系(virus-induced gene silencing,VIGS)分別對StPp27和POTHR-1基因的功能進(jìn)行缺失,隨后通過晚疫病菌的接種鑒定以及利用R基因與病

5、原菌效應(yīng)子互作的實驗證明,沉默StPRp27和POTHR-1基因后并不影響以Rpi-blb1和Rpi-blb2介導(dǎo)的對晚疫病抗性以及過敏反應(yīng)的發(fā)生,證明StPRp27和POTHR-1所介導(dǎo)的抗性屬于獨立于主效基因Rpi-blb1和Rpi-blb2的抗性系統(tǒng)。
　　 3、構(gòu)建CaMV35S啟動子驅(qū)動的StPRp27超量表達(dá)載體和干涉載體,轉(zhuǎn)化鄂馬鈴薯3號(E3)品種,對得到的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行StPRp27表達(dá)量分析顯示,超量表達(dá)株系

6、中StPRp27的表達(dá)量明顯高于對照,特異干涉轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量低于對照中的表達(dá)量。選取部分轉(zhuǎn)基因株系接種晚疫病原菌進(jìn)行抗性評價,結(jié)果顯示超量表達(dá)StPRp27基因后轉(zhuǎn)基因株系的抗晚疫病能力較對照顯著提高,而沉默StPRp27基因的轉(zhuǎn)基因株系抗病性與對照無顯著差異,證明StPRp27基因參與了馬鈴薯晚疫病抗性調(diào)節(jié),其機(jī)制可能與轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控有關(guān)。
　　 4、構(gòu)建pGEX-StRp27重組載體,將該載體在大腸桿菌BL21(DE3)

7、中進(jìn)行原核表達(dá),并對GST-StPRp27融合蛋白進(jìn)行純化,通過抑菌實驗發(fā)現(xiàn)該融合蛋白對晚疫病菌孢子囊的萌發(fā)有一定的抑制作用,該基因可能處于馬鈴薯抗病信號系統(tǒng)的下游。構(gòu)建StPRp27-GFP融合基因的表達(dá)載體,利用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),StPRp27-GFP融合基因在胞內(nèi)表達(dá),胞外和細(xì)胞壁上沒有檢測到綠色熒光。說明StPRp27蛋白可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑菌作用。將用于構(gòu)建馬鈴薯高密度圖譜(UHD)的二倍體親本材料SH8