利用病毒介導(dǎo)沉默技術(shù)高通量鑒定馬鈴薯晚疫病水平抗性相關(guān)基因功能.pdf

1、病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)技術(shù)是一種RNA介導(dǎo)的植物抗病毒防御反應(yīng)機(jī)制，VIGS實(shí)驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用在基因功能研究和高通量基因組研究中能夠高效快速的鑒定基因功能缺失后表觀性狀改變。
　　 馬鈴薯晚疫病水平抗性是一種由微效多基因控制的，具有非小種?；缘臄?shù)量抗性。其抗病程度雖然不及垂直抗性，但是對(duì)很多生理小種均有抗性，并且有著多重的抗病機(jī)制，具有廣譜性、持久性和穩(wěn)定性，同時(shí)能夠降

2、低晚疫病生理小種的選擇壓力，一定程度上延緩病原菌的變異。為了解晚疫病水平抗性的分子基礎(chǔ)，明確水平抗性形成過程中相關(guān)基因在抗性網(wǎng)絡(luò)中的位置與重要性，本研究挑選馬鈴薯晚疫病水平抗性相關(guān)基因，在本氏煙草利用VIGS技術(shù)沉默目標(biāo)基因，對(duì)目標(biāo)基因沉默煙草進(jìn)行晚疫病抗性鑒定，篩選沉默后晚疫病抗性顯著降低的目標(biāo)基因作為馬鈴薯晚疫病水平抗性重要侯選基因。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1．挑選晚疫病水平抗性相關(guān)基因，與本氏煙草cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到4

3、5個(gè)與本氏煙草同源性較高，并且含有23bp以上連續(xù)匹配序列的ESTs作為實(shí)驗(yàn)篩選的目標(biāo)基因片段。
　　 2．根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲馬鈴薯cDNA，擴(kuò)增獲得38個(gè)目標(biāo)基因片段，
　　 構(gòu)建了TRV病毒重組載體，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。
　　 3．在本氏煙草材料用VIGS技術(shù)將與目標(biāo)基因同源性較高的內(nèi)源基因進(jìn)行沉默。RT-PCR技術(shù)鑒定了部分本氏煙草內(nèi)源目標(biāo)基因沉默效果，確定VIGS實(shí)驗(yàn)體系能夠達(dá)到沉默煙草