馬鈴薯晚疫病水平抗性相關(guān)基因StPK1、StLRPK1、Star的克隆和功能分析.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L．）是世界上第四大糧食作物，在全球工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中均占有重要地位。聯(lián)合國(guó)宣布2008年為“國(guó)際馬鈴薯年”，強(qiáng)調(diào)了馬鈴薯在全球糧食系統(tǒng)中的重要地位。馬鈴薯的生產(chǎn)受到多種病蟲(chóng)害的危害，其中由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是最具毀滅性的病害。馬鈴薯晚疫病的抗性通常分為垂直抗性和水平抗性。晚疫病原菌小種變異迅速，導(dǎo)致馬鈴薯晚疫病垂直抗性并不持久。水平抗性是由微效多

2、基因控制的非小種專(zhuān)化抗性，對(duì)不同的生理小種都具有抗性，并且較為穩(wěn)定、持久。但目前對(duì)于水平抗性機(jī)理的研究還很薄弱，極大限制了抗性資源的有效利用。本研究旨在通過(guò)3個(gè)水平抗性相關(guān)基因的克隆和功能分析，探索抗性機(jī)制，主要結(jié)果如下：
　　 1．用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）的方法，從馬鈴薯水平抗性材料（剔除R1-R11）中克隆了一個(gè)新的蛋白激酶基因StPK1（Solanum tuberosum protein kinases1）。該基

3、因cDNA全長(zhǎng)1779 bp，編碼416個(gè)氨基酸。該基因全長(zhǎng)gDNA序列中具有5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子。用馬鈴薯二倍體群體PCC1將該基因定位于第Ⅸ染色體。半定量RT-PCR結(jié)果表明，晚疫病病原菌接種1 h后該基因開(kāi)始表達(dá)，而且可以持續(xù)表達(dá)36 h；
　　 2．用RACE的方法，從馬鈴薯水平抗性材料中克隆了一個(gè)新的富含亮氨酸重復(fù)的類(lèi)受體蛋白激酶基因StLRPK1（Solanum tuberosum leucine-rich-rep

4、eat receptor-like protein kinases1）。該基因cDNA全長(zhǎng)3137 bp，編碼796個(gè)氨基酸，具有1個(gè)信號(hào)肽、5個(gè)亮氨酸模體、1個(gè)跨膜域、2個(gè)脯氨酸重復(fù)區(qū)和1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶域，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）SRF3有很高的同源性（88％）。半定量RT-PCR結(jié)果表明，該基因在花和幼葉中表達(dá)水平較高，被晚疫病原菌強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，并且受SA、MJ、ETH和ABA誘導(dǎo)時(shí)呈現(xiàn)不同的表

5、達(dá)模式；
　　 3．用RACE的方法，克隆了一個(gè)馬鈴薯富含錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的基因Star（Solanum tuberosum ankyrin-rich repeat）。該基因cDNA全長(zhǎng)2047 bp，編碼514個(gè)氨基酸，與水稻（Oryza sativa）Xa21結(jié)合蛋白3有較高的同源性（78％），具有5個(gè)錨蛋白重復(fù)域和1個(gè)環(huán)指域。半定量RT-PCR結(jié)果表明，晚疫病病原菌接種24 h時(shí)，該基因開(kāi)始表達(dá)，隨后逐步增強(qiáng)；2至36 h

6、，Star一直受SA、MJ、ABA的誘導(dǎo)，而只在24至36 h受ETH誘導(dǎo)；
　　 4．分別構(gòu)建了CaMV35S驅(qū)動(dòng)下的StPK1正義基因表達(dá)載體和StPK1干涉表達(dá)載體。以馬鈴薯試管薯為受體材料，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將上述載體導(dǎo)入馬鈴薯試管薯，分別獲得“鄂馬鈴薯3號(hào)”（E3）正義超量表達(dá)株系15個(gè)，“轉(zhuǎn)心烏”（W）正義超量表達(dá)株系8個(gè)，“鄂馬鈴薯3號(hào)”（E3）干涉株系22個(gè)。Southern雜交表明每個(gè)轉(zhuǎn)基因植株有1-3個(gè)拷貝

7、。晚疫病病原菌接種實(shí)驗(yàn)表明，與未轉(zhuǎn)基因株系相比，干涉株系更抗病，而超量表達(dá)株系更感病，說(shuō)明StPK1基因?yàn)轳R鈴薯抗病反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子；
　　 5．為了研究StPK1基因負(fù)調(diào)控馬鈴薯抗病反應(yīng)的分子機(jī)理，考察了11個(gè)馬鈴薯抗病基因在接種晚疫病原菌24 h后在E3超量表達(dá)株系、E3和E3干涉株系中的表達(dá)。結(jié)果表明，有5個(gè)基因在StPK1超量表達(dá)株系中表達(dá)減弱，而在干涉株系中表達(dá)增強(qiáng)，這表明StPK1處于這5個(gè)基因的上游，且負(fù)調(diào)控它們

8、的表達(dá)；
　　 6．SA、MJ、ETH和ABA處理馬鈴薯植株時(shí)，StPK1受SA誘導(dǎo)表達(dá)從2 h一直持續(xù)到36 h，而受其它因子誘導(dǎo)并不強(qiáng)烈。用SA處理馬鈴薯植株的第3復(fù)葉，研究StPK1基因在1-6復(fù)葉的表達(dá)，結(jié)果表明，StPK1在1-6復(fù)葉中幾乎可以等量表達(dá)，這表明SA無(wú)極性地向上、向下傳遞信號(hào)。此外，被StPK1負(fù)調(diào)控的5個(gè)基因也受SA誘導(dǎo)表達(dá)。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)StPK1基因處于SA信號(hào)途徑；
　　 7．分別構(gòu)建