馬鈴薯晚疫病水平抗性相關(guān)基因StPK1、StLRPK1、Star的克隆和功能分析.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L．）是世界上第四大糧食作物，在全球工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中均占有重要地位。聯(lián)合國宣布2008年為“國際馬鈴薯年”，強調(diào)了馬鈴薯在全球糧食系統(tǒng)中的重要地位。馬鈴薯的生產(chǎn)受到多種病蟲害的危害，其中由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是最具毀滅性的病害。馬鈴薯晚疫病的抗性通常分為垂直抗性和水平抗性。晚疫病原菌小種變異迅速，導致馬鈴薯晚疫病垂直抗性并不持久。水平抗性是由微效多

2、基因控制的非小種?；剐裕瑢Σ煌纳硇》N都具有抗性，并且較為穩(wěn)定、持久。但目前對于水平抗性機理的研究還很薄弱，極大限制了抗性資源的有效利用。本研究旨在通過3個水平抗性相關(guān)基因的克隆和功能分析，探索抗性機制，主要結(jié)果如下：
　　 1．用cDNA末端快速擴增（RACE）的方法，從馬鈴薯水平抗性材料（剔除R1-R11）中克隆了一個新的蛋白激酶基因StPK1（Solanum tuberosum protein kinases1）。該基

3、因cDNA全長1779 bp，編碼416個氨基酸。該基因全長gDNA序列中具有5個內(nèi)含子和6個外顯子。用馬鈴薯二倍體群體PCC1將該基因定位于第Ⅸ染色體。半定量RT-PCR結(jié)果表明，晚疫病病原菌接種1 h后該基因開始表達，而且可以持續(xù)表達36 h；
　　 2．用RACE的方法，從馬鈴薯水平抗性材料中克隆了一個新的富含亮氨酸重復的類受體蛋白激酶基因StLRPK1（Solanum tuberosum leucine-rich-rep

4、eat receptor-like protein kinases1）。該基因cDNA全長3137 bp，編碼796個氨基酸，具有1個信號肽、5個亮氨酸模體、1個跨膜域、2個脯氨酸重復區(qū)和1個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶域，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）SRF3有很高的同源性（88％）。半定量RT-PCR結(jié)果表明，該基因在花和幼葉中表達水平較高，被晚疫病原菌強烈誘導表達，并且受SA、MJ、ETH和ABA誘導時呈現(xiàn)不同的表

5、達模式；
　　 3．用RACE的方法，克隆了一個馬鈴薯富含錨蛋白重復結(jié)構(gòu)域的基因Star（Solanum tuberosum ankyrin-rich repeat）。該基因cDNA全長2047 bp，編碼514個氨基酸，與水稻（Oryza sativa）Xa21結(jié)合蛋白3有較高的同源性（78％），具有5個錨蛋白重復域和1個環(huán)指域。半定量RT-PCR結(jié)果表明，晚疫病病原菌接種24 h時，該基因開始表達，隨后逐步增強；2至36 h

6、，Star一直受SA、MJ、ABA的誘導，而只在24至36 h受ETH誘導；
　　 4．分別構(gòu)建了CaMV35S驅(qū)動下的StPK1正義基因表達載體和StPK1干涉表達載體。以馬鈴薯試管薯為受體材料，用根癌農(nóng)桿菌介導法，將上述載體導入馬鈴薯試管薯，分別獲得“鄂馬鈴薯3號”（E3）正義超量表達株系15個，“轉(zhuǎn)心烏”（W）正義超量表達株系8個，“鄂馬鈴薯3號”（E3）干涉株系22個。Southern雜交表明每個轉(zhuǎn)基因植株有1-3個拷貝

7、。晚疫病病原菌接種實驗表明，與未轉(zhuǎn)基因株系相比，干涉株系更抗病，而超量表達株系更感病，說明StPK1基因為馬鈴薯抗病反應中的負調(diào)控因子；
　　 5．為了研究StPK1基因負調(diào)控馬鈴薯抗病反應的分子機理，考察了11個馬鈴薯抗病基因在接種晚疫病原菌24 h后在E3超量表達株系、E3和E3干涉株系中的表達。結(jié)果表明，有5個基因在StPK1超量表達株系中表達減弱，而在干涉株系中表達增強，這表明StPK1處于這5個基因的上游，且負調(diào)控它們

8、的表達；
　　 6．SA、MJ、ETH和ABA處理馬鈴薯植株時，StPK1受SA誘導表達從2 h一直持續(xù)到36 h，而受其它因子誘導并不強烈。用SA處理馬鈴薯植株的第3復葉，研究StPK1基因在1-6復葉的表達，結(jié)果表明，StPK1在1-6復葉中幾乎可以等量表達，這表明SA無極性地向上、向下傳遞信號。此外，被StPK1負調(diào)控的5個基因也受SA誘導表達。由上述實驗結(jié)果推測StPK1基因處于SA信號途徑；
　　 7．分別構(gòu)建