不同凍存條件對人顆粒脂肪活性影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　探索不同凍存條件對人顆粒脂肪活力的影響，尋求更為滿意的顆粒脂肪凍存條件，為臨床自體脂肪移植提供理論依據。
　　方法：
　　常規(guī)方法收集41例自體脂肪移植求美者大腿內側顆粒脂肪標本，經生理鹽水漂洗2次靜置分離后加入相應留存脂肪量等體積的含60%小牛血清+25%DMEM高糖培養(yǎng)基（Dulbecco Modified Eagle Medium，伯克改良伊格爾培養(yǎng)基）+15%DMSO（Dimethyl sulfox

2、ide，二甲基亞砜）低溫凍存保護液凍存。將所獲脂肪標本一式三份，按照-20℃（普通冰箱）、-80℃（深低溫冰箱）和-196℃（液氮）3種不同條件下凍存。選擇凍存3個月和6個月的標本復溫，通過蘇木精-伊紅(HE)染色觀察脂肪細胞形態(tài)、臺盼藍染色法分析脂肪細胞存活率、肌酸激酶測定酶活力、免疫組化CD105檢測脂肪干細胞數量，比較三種凍存溫度下凍存3個月及6個月后脂肪細胞活力變化情況。應用經三種溫度凍存6個月后的顆粒脂肪組織進行裸鼠體內移植建

3、模，于6只裸鼠背部皮下進行注射移植，4周后取出，測量體積、HE染色及透射電鏡觀察并比較移植后脂肪組織的成活及血管化情況。所有數據均采用SPSS17.0統計包進行數據處理及分析。
　　結果：
　　1.體外檢測脂肪細胞活力：
　　（1）臺盼藍染色法脂肪細胞計數分析脂肪細胞存活率，-20℃、-80℃、-196℃三種溫度下凍存3個月后的脂肪細胞存活率分別是18.79±2.51%、86.21±1.51%、90.05±2.77%；

4、凍存6個月后分別是8.67±1.83%、81.34±2.39%、89.31±2.65%，三組組間比較Ρ值均<0.05，差異有統計學意義。在同一凍存時間下，-20℃、-80℃及-196℃各組的脂肪細胞存活率逐漸升高，-196℃溫度凍存后存活的脂肪細胞數量最多，-20℃溫度下凍存后存活脂肪細胞數量最少（Ρ<0.05）。在同一凍存溫度下，-20℃及-80℃凍存3個月組的脂肪細胞存活率明顯高于6個月組，-196℃下兩組凍存時間無顯著性差異（Ρ>

5、0.05）。
　?。?）肌酸激酶測定，-20℃、-80℃、-196℃三種溫度下凍存3個月后的OD值是0.042±0.003、0.072±0.002、0.081±0.002；凍存6個月后分別是0.038±0.002、0.063±0.002、0.079±0.003，三組組間比較Ρ值均<0.05，差異有統計學意義。相同溫度下，-20℃和-80℃凍存3個月的酶活力高于凍存6個月（Ρ<0.05），-196℃凍存溫度下，3個月及6個月無差異（

6、Ρ>0.05）；相同凍存時間下，-196℃組酶活力最高，-80℃組次之，-20℃組最低（Ρ<0.05）。
　?。?）各組HE染色顯微鏡下比較脂肪細胞形態(tài)發(fā)現，-20℃條件下凍存3個月組細胞膜破裂嚴重，網狀連接部分中斷，偶可見細胞核存在；而6個月組細胞膜破裂更加嚴重，網狀連接中斷，細胞核幾乎消失，且存在較多壞死區(qū)及囊腔和空泡；-80℃組兩段時間較-20℃組明顯改善；-196℃條件下凍存3個月及6個月兩組間脂肪細胞形態(tài)基本保持正常，凍

7、存后基本未受損傷。各組經免疫組化CD105染色后，-20℃組未見ADSCs，在-80℃組及-196℃組僅見少數ADSCs。
　　2.顆粒脂肪裸鼠移植建模：注射移植凍存顆粒脂肪于裸鼠背部皮下，4周后取出，經-20℃、-80℃及-196℃三種溫度凍存6個月的顆粒脂肪移植后體積減少率分別為90%、65%、55%。HE染色形態(tài)學觀察發(fā)現，-20℃組脂肪細胞形態(tài)尚可，網狀纖維欠發(fā)達，仍可見細胞膜破裂情況，其余兩組存活狀況良好，可見完整脂肪小

8、葉結構，細胞形態(tài)逐漸趨于穩(wěn)定，部分血管長入。透射電鏡觀察凍存脂肪移植4周后細胞超微結構，-20℃組含較多新生脂肪細胞，-80℃及-196℃組脂肪細胞更加成熟，-196℃組已可見成熟脂肪細胞輪廓，并且在脂肪細胞周圍長入的新生毛細血管數量最多。
　　結論：
　　1、使用經凍存的顆粒脂肪組織進行移植具可行性。
　　2、-196℃凍存組脂肪細胞活性優(yōu)于-80℃及-20℃凍存組。
　　3、-196℃下可凍存6個月，甚至更長