大鼠肝細胞分離培養(yǎng)與凍存復(fù)蘇的實驗研究.pdf

1、洲 民 洲 片 、 學(xué) 硯 攀 門 尼 氣 吐 士 月 片 究 生 朔 陣 3 1 肚 翻 侖 J 憶大鼠 肝細胞分離培養(yǎng)與凍存復(fù)蘇的實 驗研究研 究 背 景 : k中 文摘要細胞移植術(shù)已 成為治療肝功能衰竭及先天性肝代謝性疾病領(lǐng)域的熱門課題。肝細胞移植的成功不但需要大量保持正常功能和增殖活力的 肝細胞， 而且還需 要為移植術(shù)隨時 提供充足的肝細胞，因此肝細胞的分離培養(yǎng)與凍存復(fù)蘇技術(shù)是肝細胞移植研究中重要的環(huán)節(jié)。肝細胞的冷凍保存有望成為

2、解決移植肝細胞供需矛盾的理想方式。但肝細胞對外界環(huán)境的 變化十分敏感，很容易在凍存復(fù)蘇過程中受到損傷。 雖然已 有大量新鮮肝細胞凍存復(fù)蘇的 研究報道，迄今尚未見到令人滿意的肝細胞冷凍貯存方法目 的: 研究分離 S p r a g u e - D a w l e y ( S D ) 大鼠 肝細胞 方法及短期培養(yǎng)后對肝細胞活率、形態(tài)和功能的影響;并探討不同 冷凍降溫程凍存前培養(yǎng)不同時間對肝細胞活率及功能的影響法:采用膠原酶原位循環(huán)灌注法分離

3、大鼠肝細胞，臺盼藍染計算分離后細胞活率及細胞數(shù)。游離肝細胞在含 2 0 %小牛血清R P N H 1 6 4 0合成培養(yǎng)基內(nèi) 培養(yǎng)一周。 光、電 鏡下觀察短期培養(yǎng)過色的程中肝細胞形態(tài)的變化，并測定細胞內(nèi)生化指標(biāo)。取三組新鮮分離的 肝細 胞分別培 養(yǎng) O h ( A組 ) 、 2 4 h ( B組 ) 、 4 8 h ( C組 ) ， 將 培 養(yǎng) 不同 時間的肝細胞清洗后重懸于含 2 0 % 小牛血清和 1 0 % 二甲 亞楓的冷凍保存液

4、中 。 將肝細 胞 懸液置于凍 存管中 并 采 用速率 程 控降 溫程 序 I ( - 1 0 C/ m i n 至一 8 C， - 6 ' C / m i n 至 一 1 5 C ， 保持 1 0 m i n ， - V C / m i n 至一 3 0 - C , - 3 C / m i n至 一 8 0 0 C ) 凍存后投入 液氮保存。 三天后， 取出 肝細 胞于 4 0 ℃ 水浴快速復(fù)蘇并繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，檢測

5、復(fù)蘇后肝細胞活率、形態(tài)及細胞功能的改變。結(jié)果:( 1 ) 游離肝實質(zhì)細胞的純度可達 9 5 %，細胞活率約 9 5 0 / x 9 6 % ， 平均每只 大鼠 可獲取3 . 6 X 1 0 ' 個肝細胞; 經(jīng) 過短期 培養(yǎng)，肝細胞內(nèi)的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、 堿性磷酸酶仍具有較高活力，且肝細胞仍具有一定合成蛋白 質(zhì)的能力。 ( 2 ) 凍存復(fù)蘇后各組的平均回收 率、 活 率 分 別 為: A 組 ( 培 養(yǎng)O h 組 ) : 3 1

6、. 7 5 % , 2 8 . 6 5 % , B 組 ( 培 養(yǎng)2 4 h組) : 6 4 . 2 5 % , 5 4 . 7 5 % . C組 ( 培養(yǎng)4 8 h 組 ) : 6 9 . 7 5 % , 6 3 . 0 0 % a A , B— 一 — ， 一 一 ~ ~ ~ ~ ~ . - - - - - - - 一 - - ~ ~ ， 吮 告月 自洲 扮 A 習(xí) .吐舉 口 吧 月 吸 P A . 4 呀 ， 吧

7、 月 匕 月 卜 N 七 栩 侖 j 七丫，軍E x p e r i m e n t a l r e s e a r c h o n i s o l a t i o n , c u l t u r e ,c r yo p r e s e r v a t i o n a n d t h a w i n g o f r a t h e p a t o c y t e s .Ab s t r a c tB a c k g r

8、 o u n d : H e p a t o c y t e t r a n s p l a n t a t i o n c o u l d b e a n a l t e r n a t i v et h e r a p y f o r h e p a t i c f a i l u r e a n d c o n g e n i t a l m e t a b o l i c d i s e a s e s

9、 . S u c c e s s f u lh e p a t o c y t e t r a n s p l a n t a t i o n r e q u i r e s p l e n t y o f d o n o r h e p a t o c y t e s , w h i c h r e t a i n n o r m a l f u n c t i o n a n d p r o l i f e

10、r a t i v e c a p a b i l i t i e s , a n d a r e r e a d i l ya v a i l a b l e f o r o n - d e m a n d t r e a t m e n t . T h e r e f o r e , t h e t e c h n i q u e o f i s o l a t i o n ,c u l t u r e a

11、 n d s t o r a g e o f h e p a t o c y t e s a r e p i v o t a l i n t h e h e p a t o c y t et r a n s p l a n t a t i o n . B a n k i n g o f c r y o p r e s e r v e d h e p a t o c y t e s i s s u p p o

12、s e d t o f u f i l l t h e a f o r e m e n t i o n e d r e q u i r e m e n t . U n f o r t u n a t e l y , h e p a t o c y t e s a r e s os e n s i t i v e t o t h e c h a n g e s o f e n v i r o n m e n t

13、, t h a t t h e y a r e e a s i l y d a m a g e dd u r i n g f r e e z i n g a n d t h a w i n g p r o c e d u r e . T h e r e h a v e b e e n n u m e r o u s r e s e a r c h e s o n c r y o p r e s e r v

14、a t i o n o f f r e s h l y i s o l a t e d h e p a t o c y t e s , b u t t h e r e i s n o o n e s i n g l e c r y o p r e s e r v a t i o n p r o c e d u r e t h a t i s u n i v e r s a l l y a d o p t e

15、 d .O 坷 e c t i v e : T o f i n d t h e m e t h o d f o r l a r g e s c a l e i s o l a t i o n o f S D r a th e p a t o c y t e s a n d e v a l u a t e t h e v i a b i l i t y a n d f u n c t i o n o f

16、 r a t h e p a t o c y t e s i n v i t r o s h o r t - t e r m c u l t u r e ; T o i n v e s t i g a t e t h e e f e c t s o f c o o l i n g p r o g r a m sa n d d i f e r e n t c u l t u r e t i m e b e

17、f o r e c r y o p r e s e r v a t i o n o n t h e v i a b i l i t y a n df u n c t i o n o f r a t h e p a t o c y t e s .Me t h o d : R a t h e p a t o c y t e s w e r e i s o l a t e d b y a n i n - s i

18、t u c o l a g e n a s ec y c l e p e r f u s i o n t e c h n i q u e m o d i f i e d f r o m S e g l e n m e t h o d ; T h e 戶 e l d a n d v i a b i l i t y o f t h e h e p a t o c y t e s w e r e a s s e s

19、 s e d b y t r y p a n b l u e e x c l u s i o n . T h ei s o l a t e d h e p a t o c y t e s w e r e t h e n c u l t u r e d i n R P M I - 1 6 4 0 c u l t u r e m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h

20、 2 0 % c a l f s e r u m f o r o n e w e e k . D u r i n g t h e p e r i o d , t h ea c t i v i t y o f g l u t a m i c - o x a l o a c e t i c t r a n s a m i n a s e ( A S T ) a n d a l k a l i n e p h o s

21、p h a t a s e ( A L P ) a n d t h e c o n t e n t o f t o t a l p r o t e i n ( T P ) i n t h e h e p a t o c y t e sw e r e d e t e r m i n e d . T h e l e a k a g e o f l a c t a t e d e h y d r o g e n

22、a s e ( L D H ) i n t h em e d i a w a s a l s o e x a m i n e d . T h e i s o l a t e d h e p a t o c y t e s w e r e d i v i d e d i n t ot h r e e g r o u p s a n d c u l t u r e d f o r O h , 2 4 h ,

23、 4 8 h , r e s p e c t i v e l y . T h e n t h eh e p a t o c y t e s w e r e s u s p e n d e d i n a f r e e z i n g m e d i u m c o n t a i n i n g 2 0 % c a l fs e r u m a n d 1 0 % D MS O . A l i q u