Nos2在小鼠肝損傷中的作用研究.pdf

1、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是一種同工酶，有三種亞型，Nos1、Nos2、Nos3，分別對(duì)應(yīng)nNos，iNos，eNos。一氧化氮合酶2(NOS2)在細(xì)胞受到刺激被激活后發(fā)揮作用，所生成的NO數(shù)量較多。研究表明NOS2在慢性神經(jīng)變性疾病、炎癥、梗阻性病變、腫瘤、移植/植入、損傷、抗寄生蟲感染中發(fā)揮重要作用，先前研究Nos2敲除在年輕小鼠中的作用，但其在老齡化小鼠肝損傷中的作用尚不清楚。
　　隨

2、著老年人口逐漸增多，患有肝病需部分肝切除的老年人數(shù)也有了明顯上升的趨勢(shì)，而老年人大部分肝切除后有更高的死亡率和發(fā)病率。由NOS2合成的NO在肝臟部分切除后的肝臟再生中起著非常重要的作用。在該研究中，我們檢測(cè)敲除Nos2基因?qū)δ昀闲∈蟛糠指吻谐蟾闻K再生的影響，用24個(gè)月大Nos2敲除的和野生型的C57BL/6小鼠進(jìn)行2/3肝切除，收集肝切除后11個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肝組織材料。手術(shù)后生存率，肝系數(shù)，即刻早期基因，增殖相關(guān)蛋白Ki67，細(xì)胞周期相關(guān)

3、基因Cyclin A2，Cyclin D1，Cyclin B1，增殖通路相關(guān)蛋白JNK，NF-κB，STAT3及凋亡相關(guān)蛋白Caspase3，Caspase9，BCL2，BAX分別被檢測(cè)。在肝再生的終止階段，Nos2敲除的老年小鼠有更低的生存率(P=0.039)和較低的肝系數(shù)(從120小時(shí)到192小時(shí)，P=0.020，0.047和0.002);即刻早期基因Fos在肝再生的早期階段表達(dá)上升，中后期階段表達(dá)下降;Jun表達(dá)在肝再生早期無差異

4、，中后期表達(dá)下降;Cyclin D1，Cyclin A2，Cyclin B1的表達(dá)降低和延遲;凋亡基因Caspase3，Caspase9的蛋白表達(dá)上升，促凋亡基因BAX的蛋白表達(dá)也上升。增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STAT3，NF-κB，JNK表達(dá)下降和延遲。Nos2基因敲除的老年小鼠肝再生變慢，主要通過凋亡的增加和增殖變慢。
　　CCl4誘導(dǎo)的嚙齒動(dòng)物的急性肝衰竭與人類的急性肝衰竭在形態(tài)和生化觀點(diǎn)上相似。由NOS2合成的NO在急性肝衰竭中起

5、著重要的作用，在此實(shí)驗(yàn)中，我們研究Nos2敲除對(duì)CCl4誘導(dǎo)的老年小鼠急性肝衰竭的影響，用CCl4處理24個(gè)月大的Nos2敲除小鼠和野生型的C57BL/6小鼠，誘導(dǎo)急性肝衰竭，在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)收集血清和肝組織材料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nos2 KO小鼠血清中ALT、AST的含量在肝衰竭后大部分時(shí)間高于野生型小鼠中的含量，CCl4處理的野生型小鼠中的Nos2基因的表達(dá)量比正常野生型小鼠高，在16h左右時(shí)達(dá)到最高，后期下降。炎癥因子Tnf-a、IL

6、-6、Ifn-γ、 Emr1的mRNA表達(dá)量在Nos2 KO小鼠的大部分時(shí)間點(diǎn)比野生型小鼠高，并且Nos2 KO小鼠中的IL-6、Mcp-1、Ccr2的mRNA表達(dá)量升高比較明顯。通過觀察H.E染色的肝組織切片，Nos2 KO小鼠中CCl4處理后期階段的脂肪滴比野生型小鼠多和偏大，通過免疫印跡分析肝功能基因SOD2、BCHE的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Nos2 KO老年小鼠在急性肝衰竭過程中SOD2和BCHE的表達(dá)比野生型老年小鼠低。我們進(jìn)一步檢測(cè)凋亡

7、相關(guān)基因Caspase3，Caspase9，Bcl2，Bax的表達(dá)變化，在Nos2 KO老年小鼠和WT老年小鼠中，細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白CASPASE3和CASPASE9的表達(dá)在CCl4處理后的兩種老年小鼠中后期都上升，且Nos2 KO老年小鼠的CASPASE3和CASPASE9的表達(dá)量高于WT老年小鼠。WT老年小鼠與Nos2 KO老年小鼠相比抑制細(xì)胞凋亡蛋白BCL2的表達(dá)量在部分時(shí)間點(diǎn)升高。Nos2 KO老年小鼠與WT老年小鼠相比促凋亡蛋白