Toll樣受體在小鼠自身免疫性肝損傷發(fā)生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、Toll樣受體作為一種重要的模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別病源微生物的結(jié)構(gòu)組分和代謝產(chǎn)物。TolI樣受體不僅在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用，而且也參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。肝臟是機(jī)體最大的解毒器官，長(zhǎng)期接觸來(lái)自腸道的病原體成分。大量證據(jù)表明，病源微生物和Toll樣受體與肝臟疾病進(jìn)程有密切關(guān)系，但是Toll樣受體及其下游信號(hào)影響肝臟疾病進(jìn)程的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本課題旨在利用小鼠肝臟損傷模型進(jìn)一步探討Toll樣受體影響肝損傷發(fā)生發(fā)展的機(jī)制：一方面

2、，我們發(fā)現(xiàn)TLR3信號(hào)可以通過(guò)下調(diào)巨噬細(xì)胞上TLR4表達(dá)，從而減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠爆發(fā)性肝損傷：另一方面，CpG-TLR9信號(hào)能特異性募集和活化肝臟NKT細(xì)胞，并加重Con A誘發(fā)的小鼠急性肝損傷。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們采用賴氏法檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶水平、ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子水平，組織染色方法觀察肝臟病理學(xué)變化，利用以上指標(biāo)綜合評(píng)估肝臟損傷程度；通過(guò)抗體清除、細(xì)胞轉(zhuǎn)輸、細(xì)胞純化和殺傷實(shí)驗(yàn)，研究特定淋巴細(xì)胞群體在肝臟損傷過(guò)程中的作用；采用流式細(xì)

3、胞術(shù)測(cè)定巴細(xì)胞亞群的表型和受體分子的表達(dá)，并對(duì)其活化狀態(tài)和細(xì)胞因子分泌功能進(jìn)行分析；用Westem blotting的方法檢測(cè)胞內(nèi)信號(hào)分子的活化。通過(guò)上述研究方案獲得了如下結(jié)果： TLR3配基通過(guò)下調(diào)巨噬細(xì)胞上TLR4的表達(dá)抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的爆發(fā)性肝損傷首先，我們發(fā)現(xiàn)低劑量TLR3配基(poly I：C)預(yù)處理小鼠能減輕LPS/D-GalN聯(lián)合注射誘導(dǎo)的爆發(fā)性肝損傷。LPS/D-GAIN聯(lián)合注射引起的小鼠高死亡率、血清中轉(zhuǎn)氨酶和

4、TNF-α水平大幅升高及大片肝細(xì)胞壞死在poly I：C預(yù)處理后得到顯著改善，證明poly I：C能減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷。通過(guò)細(xì)胞清除和細(xì)胞轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)分別清除體內(nèi)NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、αβ T細(xì)胞和γδ T細(xì)胞均不能影響poly I：C對(duì)肝臟損傷的保護(hù)效果，這就證明NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和T細(xì)胞在此過(guò)程中不起作用：然而，給清除巨噬細(xì)胞的小鼠轉(zhuǎn)輸poly I：C預(yù)先處理過(guò)的腹腔巨噬細(xì)胞能有效抑制肝臟損傷發(fā)生，表明poly I：C

5、是直接作用于巨噬細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝損傷的保護(hù)。 同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示poly I：C注射能夠下調(diào)巨噬細(xì)胞表面LPS受體TLR4的表達(dá)并影響其下游炎癥信號(hào)的活化。Poly I：C體內(nèi)和體外處理均能下調(diào)小鼠肝臟巨噬細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)，同樣的結(jié)果也在巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞上得到驗(yàn)證。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，poly I：C體外處理RAW264.7細(xì)胞能抑制LPS/TLR4下游信號(hào)分子ERK1/2、p38MlAPK、SAPK/JNK

6、和。NF-κB的活化。此外，anti-TLR3抗體能阻斷poly I：C對(duì)巨噬細(xì)胞表面TLR4的下調(diào)作用，提示poly I：C通過(guò)TLR3通路影響TLR4的表達(dá)。TLR9配基募集和活化肝臟NKT細(xì)胞從而加重Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)TLR9的配基CpG ODN處理后，小鼠肝臟NKT細(xì)胞的數(shù)目和狀態(tài)發(fā)生特異性變化：數(shù)目增加，細(xì)胞表面CD69和Fas L的表達(dá)上升，分泌細(xì)胞因子的能力和對(duì)肝細(xì)胞的天然殺傷能力增強(qiáng)。清除小鼠

7、體內(nèi)巨噬細(xì)胞后，CpGODN對(duì)肝臟NKT細(xì)胞的作用被明顯削弱。同時(shí)，CpG ODN處理過(guò)的巨噬細(xì)胞及其細(xì)胞上清都可以增強(qiáng)肝臟NKT細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞的殺傷。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，anti-IL-12中和性抗體能夠抑制這種效果。這些結(jié)果提示我們巨噬細(xì)胞對(duì)肝臟NKT細(xì)胞的作用依賴細(xì)胞間接觸和可溶性因子的共同作用。 基于CpG ODN對(duì)肝臟NKT細(xì)胞的特殊作用，我們觀察了CpG ODN對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型的影響。我們發(fā)現(xiàn)CpG

8、ODN預(yù)注射能加重Con A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。轉(zhuǎn)氨酶、組織病理和血清中炎癥性細(xì)胞因子的結(jié)果均顯示CpG ODN預(yù)處理組中肝臟損傷明顯加重；而且CpG ODN預(yù)處理也能增強(qiáng)Con A注射后肝臟NKT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力。 綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(1)Poly I：C通過(guò)TLR3下調(diào)小鼠肝臟巨噬細(xì)胞表面LPS受體TLR4的表達(dá)，從而影響TLR4下游炎癥信號(hào)的活化，并抑制了LPS/D-GalN聯(lián)合注射誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠爆發(fā)性肝