小鼠肝星狀細(xì)胞旁分泌機(jī)制在急性肝損傷再生修復(fù)中的作用.pdf

1、急肝衰竭全球發(fā)病率較高，病情兇險(xiǎn)，預(yù)后較差，內(nèi)科藥物治療病死率高；由于供肝缺乏及免疫排斥問(wèn)題臨床上僅約10％的患者實(shí)施了肝移植；肝細(xì)胞移植治療和生物型人工肝輔助系統(tǒng)的應(yīng)用也由于種子細(xì)胞來(lái)源缺乏和細(xì)胞移植后增殖效率低下而受到限制。因此急性肝衰竭的治療一直是臨床上亟待解決的難題。干細(xì)胞生存微環(huán)境(stem cell niche)是干細(xì)胞生活的特定環(huán)境，維持并調(diào)節(jié)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，使之在靜息態(tài)、自我更新和分化上保持平衡。深入研究肝臟干細(xì)胞n

2、iche的結(jié)構(gòu)與功能將充分激發(fā)內(nèi)源性肝臟干細(xì)胞在肝臟再生中的修復(fù)潛能。這種方法不需要外源性的供體，也不存在免疫排斥的問(wèn)題，是肝損傷疾病治療的理想方法。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)作為肝臟干細(xì)胞niche中重要的支持細(xì)胞在肝臟再生中的作用及機(jī)制尚未闡明。本研究首先明確了活化的HSCs在急性肝損傷再生修復(fù)中的作用；接著建立了小鼠肝星狀細(xì)胞分離純化和體外培養(yǎng)模型，并觀察不同活化階段HSCs的生物學(xué)特性；

3、最后探明活化的HSCs旁分泌途徑是否參與急性肝損傷再生修復(fù)的過(guò)程并闡述相關(guān)作用機(jī)制。
　　第一部分小鼠肝星狀細(xì)胞活化不良對(duì)急性肝損傷再生修復(fù)的影響
　　目的：明確活化的小鼠肝星狀細(xì)胞(mouse hepatic stellate cells，m-HSCs)在急性肝損傷時(shí)是否具有促進(jìn)肝細(xì)胞有絲分裂和/或肝臟干細(xì)胞增殖的作用。
　　方法：在對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)誘導(dǎo)的化學(xué)性急性肝損傷小鼠模型基

4、礎(chǔ)上，通過(guò)連續(xù)腹腔注射膠毒霉素(gliotoxin，1mg/kg體重)消除肝內(nèi)活化的星狀細(xì)胞，建立肝星狀細(xì)胞活化不良(loss of function)模型。通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，觀察gliotoxin對(duì)肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的影響。并利用該模型，從小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶濃度、生存分析、肝細(xì)胞壞死及凋亡程度、CD45陽(yáng)性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度、肝細(xì)胞和卵圓細(xì)胞增殖能力等方面評(píng)估活化的HSCs在肝急性損傷再生修復(fù)中的作用。
　　結(jié)果：膠毒霉素的肝

5、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，膠毒霉素(3mg/kg體重)單次腹腔注射后，與對(duì)照組相比，在血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST。的濃度、肝損傷組織學(xué)評(píng)分、肝細(xì)胞增殖能力方面均無(wú)明顯差異(P>0.05)。m-HSCs活化不良模型中發(fā)現(xiàn)，Gliotoxin組活化的HSCs(α-SMA+-HSCs)數(shù)目為(13.13±2.92)/FOV，較對(duì)照組(130.12±20.44)/FOV下降90％，存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。碳顆粒吞噬實(shí)驗(yàn)顯示，兩組小鼠肝內(nèi)碳顆粒

6、陽(yáng)性Kupffer細(xì)胞的數(shù)目無(wú)明顯差異(P>0.05)。Gliotoxin組與對(duì)照組相比，血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST的濃度分別升高73％(P<0.05)和72％(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。生存分析提示，Gliotoxin組小鼠5天生存率明顯下降為55％，對(duì)照組為89％，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。Gliotoxin組與對(duì)照組相比，肝損傷組織學(xué)評(píng)分分別為(2.41±0.52)和(3.43±0.74)，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

7、<0.01)；CD45陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)目分別為(146.49±52.87)/FOV和(99.06±26.35)/FOV，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；凋亡的肝細(xì)胞數(shù)目分別為(16.94±9.33)/FOV和(4.29±3.06)/FOV，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；BrdU陽(yáng)性肝細(xì)胞的數(shù)目減少66％，分別為(3.83±1.92)/FOV和(11.29±5.21)/FOV，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，同時(shí)5個(gè)肝細(xì)

8、胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)程度出現(xiàn)不同程度下降，為(0.2～4.3)倍；其中OSM、EGF、IL6基因的表達(dá)水平明顯下降，兩組間具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，HGF、SCF基因的表達(dá)水平也出現(xiàn)下降，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝內(nèi)PanK陽(yáng)性卵圓細(xì)胞(Oval cell，OVc)的數(shù)目分別為(7.64±4.03)/FOV和(8.54±4.14)/FOV，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，同時(shí)Gliotoxin組CK19基因

9、的表達(dá)程度明顯下降(P<0.05)。
　　結(jié)論：肝星狀細(xì)胞活化不良加重APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷；肝星狀細(xì)胞活化不良同時(shí)導(dǎo)致肝細(xì)胞有絲分裂能力下降和卵圓細(xì)胞增殖能力下降。
　　第二部分小鼠肝星狀細(xì)胞分離純化和體外培養(yǎng)模型的建立
　　目的：建立小鼠肝星狀細(xì)胞分離純化的高效穩(wěn)定方案，并通過(guò)原代和傳代培養(yǎng)觀察其生物學(xué)特性的變化。
　　方法：采用二氯亞甲基二膦酸脂質(zhì)體(CL2MDP-liposome)腹腔注射(10ml/k

10、g體重)預(yù)處理小鼠，三天后依次應(yīng)用預(yù)灌注液、0.1％Pronase E、0.075％CollagenaseNB4G對(duì)在體肝臟原位灌注消化。肝臟離體后，在0.02％DNaseⅠ液中磁力攪拌消化10min，低速離心(25g，5min)去除殘余肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步用Optiprep密度梯度液獲得純化的m-HSCs。采用碳顆粒吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Kupffer細(xì)胞的吞噬功能；臺(tái)盼藍(lán)染色法評(píng)估細(xì)胞得率及活率；采用自發(fā)熒光及油紅O染色鑒定細(xì)胞純度；采用光鏡、

11、電鏡以及Desmin/α-SMA免疫熒光雙染色觀察不同培養(yǎng)階段HSCs的細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特征。
　　結(jié)果：C57BL/6小鼠24只，體重(22.47±1.13)g，肝重(1.30±0.14)g，肝重和體重比為1:17.28。CL2MDP-liposome預(yù)處理后的小鼠分離得到的原代m-HSCs數(shù)量為(1.62±0.34)×106/g肝臟，細(xì)胞純度為(94.44±1.89)％，細(xì)胞活率為(94.41±1.50)％；PBS-lipos

12、ome組m-HSCs的細(xì)胞得率為(1.37±0.23)×106/g肝臟，細(xì)胞純度為(90.18±1.61)％，細(xì)胞活率為(94.51±1.61)％。CL2MDP-liposome組m-HSCs在細(xì)胞得率和細(xì)胞純度方面均優(yōu)于PBS-liposome組(P<0.05/P<0.01)；兩組間細(xì)胞活率無(wú)明顯差異(P>0.05)，兩組細(xì)胞經(jīng)第一次傳代培養(yǎng)后細(xì)胞純度均接近100％。靜止期和不同活化階段的m-HSCs在亞顯微結(jié)構(gòu)以及α-SMA表達(dá)強(qiáng)度

13、方面存在差異。
　　結(jié)論：二氯亞甲基二膦酸脂質(zhì)體能選擇性清除肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞，并提高m-HSCs分離的細(xì)胞得率和細(xì)胞純度；通過(guò)改良在體肝臟灌注消化過(guò)程，優(yōu)化密度梯度離心技術(shù)，成功建立了高效穩(wěn)定的m-HSCs分離純化及體外培養(yǎng)模型；早期活化階段和完全活化階段的m-HSCs在細(xì)胞表型和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面存在差異性。
　　第三部分小鼠肝星狀細(xì)胞旁分泌因子在急性肝損傷再生修復(fù)中的作用
　　目的：明確活化的HSCs旁分泌因子在

14、急性肝損傷再生修復(fù)中的作用及機(jī)制。方法采用原代培養(yǎng)第5天和傳代培養(yǎng)第三代的HSCs分別制備成早期活化階段和完全活化階段的HSCs旁分泌因子，應(yīng)用蛋白芯片進(jìn)行蛋白成分差異性分析；分別將早期活化階段和完全活化階段的HSCs旁分泌因子通過(guò)小鼠尾靜脈進(jìn)行體內(nèi)移植，觀察兩者對(duì)APAP(750mg/kg體重)誘導(dǎo)的急性肝衰竭的治療作用，并從促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞壞死及凋亡、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)水平三方面評(píng)估HSCs旁分泌因子的作用及機(jī)制；采用早期活化的HSC

15、s旁分泌因子作為條件培養(yǎng)基在體外與肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從抗APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷、促細(xì)胞增殖及代謝功能方面評(píng)估其作用；進(jìn)一步分離培養(yǎng)小鼠成體肝臟干細(xì)胞(adult hepatic progenitor cell，AHPC)，將早期活化的HSCs旁分泌因子作為條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其對(duì)AHPC增殖及代謝能力的影響。
　　結(jié)果：
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：與HSC-CM(P3)組、對(duì)照組小鼠相比，HSC-CM(5d)組小鼠血清ALT濃度分別

16、下降42％和46％：AST濃度分別下降42％和45％；均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；HSC-CM(P3)組與對(duì)照組相比，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。急性肝損傷組織學(xué)評(píng)分，提示HSC-CM(5d)組、HSC-CM(P3)組和對(duì)照組的評(píng)分分別為(2.25±0.45)、(3.51±0.57)和(3.75±0.51)；HSC-CM(5d)組的評(píng)分低于HSC-CM(P3)組和對(duì)照組，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01/P<0.05)。HSC-CM(P3)組

17、和對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。生存分析提示，HSC-CM(5d)組小鼠5天生存率為85％；HSC-CM(P3)組為51％；對(duì)照組(Vehicle)為42％，HSC-CM(5d)組生存率明顯優(yōu)于對(duì)照組，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；HSC-CM(5d)組與HSC-CM(P3)組相比以及HSC-CM(P3)組與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步以HSC-CM(5d)為對(duì)象進(jìn)行重點(diǎn)研究，經(jīng)過(guò)尾靜脈移植后，HSC-CM(5d)組和對(duì)照組肝內(nèi)

18、CD45陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞數(shù)分別為(45.58±28.72)/FOV和(125.20±54.05)/FOV，兩組之間存在顯著差異(P<0.01)。全身炎癥反應(yīng)水平方面，與對(duì)照組相比，HSC-CM(5d)組小鼠血清IL6濃度無(wú)明顯下降；而前炎癥細(xì)胞因子IFNγ、IL1ra、IL1β的濃度均出現(xiàn)不同程度的下降，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；TNFα下降68％，兩組間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；抗炎細(xì)胞因子IL10的濃度明顯升高(

19、P<0.05)，是對(duì)照組的1.9倍。肝細(xì)胞凋亡方面，HSC-CM(5d)組肝內(nèi)TUNEL陽(yáng)性的肝細(xì)胞核數(shù)為(3.93±1.77)/FOV，與對(duì)照組的(23.52±4.02)/FOV相比，減少83％，兩組之間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。肝細(xì)胞有絲分裂方面，對(duì)照組肝內(nèi)BrdU陽(yáng)性的肝細(xì)胞核數(shù)為(5.05±3.14)/FOV；與之相比，HSC-CM(5d)組增多2倍，為(15.60±7.19)/FOV，兩組之間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<

20、0.01)；進(jìn)一步從基因水平驗(yàn)證，提示與對(duì)照組相比，HSC-CM(5d)組肝內(nèi)5個(gè)肝細(xì)胞增殖相關(guān)基因(OSM、IL6、HGF、EGF、SCF)的表達(dá)水平均發(fā)生不同程度的上調(diào)，升高幅度約為(2～32)倍。肝臟干細(xì)胞增殖方面，對(duì)照組肝內(nèi)PanK陽(yáng)性的OVc數(shù)為(7.26±2.56)/FOV；與之相比，HSC-CM(5d)組為(8.97±3.75)/FOV，兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。進(jìn)一步行RT-PCR提示，HSC-CM(5d)

21、組肝組織內(nèi)CK19和EpCAM基因的表達(dá)水平均發(fā)生上調(diào)，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01/P<0.05)。蛋白芯片：進(jìn)行蛋白成分差異性分析提示，早期活化和完全活化的HSCs旁分泌因子共同表達(dá)所檢測(cè)的144種細(xì)胞因子中的69種。兩者整體構(gòu)成相似，均主要由細(xì)胞趨化因子、細(xì)胞素、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、細(xì)胞外間質(zhì)修復(fù)相關(guān)因子等構(gòu)成。對(duì)69種細(xì)胞因子進(jìn)行組間比較，發(fā)現(xiàn)濃度相差2倍以上的細(xì)胞因子共7種，分別為單核細(xì)胞趨化蛋白-1、巨噬細(xì)胞炎性趨

22、化蛋白-1γ、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素10、間質(zhì)金屬蛋白酶-2、干細(xì)胞因子和Fas蛋白配體。體外實(shí)驗(yàn)：APAP誘導(dǎo)的體外肝細(xì)胞損傷提示，在APAP濃度為1.25mmol/L時(shí)，HSC-CM(5％)組細(xì)胞活性優(yōu)于HSC-CM(10％)組，分別為(86.17±4.84)％和(78.01±5.10)％，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；當(dāng)APAP濃度達(dá)到5mmol/L時(shí)，三組細(xì)胞的活性相比，HSC-CM(5％)組細(xì)胞活性為(45.67±

23、2.23)％，分別優(yōu)于對(duì)照組的(42.33±2.58)％和HSC-CM(10％)組的(39.34±3.33)％，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在其他的APAP濃度時(shí)，三組間細(xì)胞活性相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。將HSC-CM(5d)作為條件培養(yǎng)基與肝細(xì)胞培養(yǎng)后，BrdU摻合實(shí)驗(yàn)提示對(duì)照組中BrdU陽(yáng)性肝細(xì)胞數(shù)目為(34.40±13.23)/FOV，而HSC-CM(5d)組增多47.97％，為(50.90+17.10)/FOV，兩組相比存在統(tǒng)計(jì)

24、學(xué)差異(P<0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞的代謝功能提示，對(duì)照組和HSC-CM(5d)組細(xì)胞上清液中Albumin的濃度分別為(4.35±1.33)μg/ml/d和(6.56±2.32)μg/ml/d，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。對(duì)照組和HSC-CM(5d)組細(xì)胞上清液中Urea的濃度分別為(13.44±6.12)μg/ml/d和(23.74±8.84)μg/ml/d，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。將HSC-CM(5d)作

25、為條件培養(yǎng)基與AHPC培養(yǎng)后，HSC-CM(5d)組和對(duì)照組細(xì)胞的克隆形成率分別為(29.18±3.71)％和(21.08±2.94)％，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。BrdU摻合實(shí)驗(yàn)提示對(duì)照組BrdU和Albumin雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目為(73.50±17.81)/FOV，而HSC-CM(5d)組增多66.12％，為(122.10±26.28)/FOV，兩組相比存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞的代謝功能提示，HS

26、C-CM(5d)組細(xì)胞上清液中Albumin的濃度為(14.47±3.04)μg/ml/d，比對(duì)照組的(8.93±2.52)μg/ml/d提高62.04％，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。HSC-CM(5d)組細(xì)胞上清液中Urea的濃度為(34.83±12.21)μg/ml/d，比對(duì)照組的(20.87.44±9.53)μg/ml/d提高66.89％，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：活化的HSCs通過(guò)旁分泌途

27、徑參與急性肝損傷再生修復(fù)過(guò)程；早期活化階段和完全活化階段的HSCs旁分泌因子在急性肝損傷再生修復(fù)中的作用存在差異；早期活化階段的HSCs旁分泌因子具有保護(hù)肝損傷和促進(jìn)肝修復(fù)的作用，機(jī)制包括：抗肝細(xì)胞壞死/凋亡，促肝細(xì)胞/肝臟干細(xì)胞增殖，下調(diào)炎癥反應(yīng)水平。
　　全文結(jié)論：
　　1.活化的HSCs具有減輕急性肝損傷；促進(jìn)肝細(xì)胞/肝臟干細(xì)胞增殖的作用。
　　2.活化的HSCs通過(guò)旁分泌途徑發(fā)揮急性肝損傷的保護(hù)作用并促進(jìn)肝臟再