PDCD4在脂多糖-d-半乳糖胺誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中的作用研究.pdf

1、目的：
　　 程序性死亡因子4，PDCD4(programmedcelldeath4，PDCD4)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，現(xiàn)已證實(shí)它可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控多種基因的表達(dá)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。我們的前期研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)PDCD4在卵巢癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用，然而，最近一些研究顯示PDCD4在許多炎癥性疾病中也發(fā)揮了重要的作用。已有報(bào)道，PDCD4基因敲除（Pdcd-/-4）小鼠抵抗I型糖尿病及實(shí)驗(yàn)性自

2、身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)的發(fā)生，并且可以降低脂多糖(lipopolysacchrides，LPS)誘導(dǎo)的小鼠死亡率。上述結(jié)果提示PDCD4是一個(gè)促炎蛋白。然而，另外有報(bào)道指出，PDCD4敲除的RAW264.7巨噬細(xì)胞系經(jīng)LPS刺激后可以產(chǎn)生更多的促炎因子TNF-α，這提示PDCD4是一個(gè)抗炎因子。因此，PDCD4在炎癥中的作用目前仍不清晰。
　　 由腸源性內(nèi)毒素導(dǎo)致的急性肝損傷是臨床上常見的肝功能衰竭和患者死亡的原因之一。內(nèi)

3、毒素是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分—LPS，它可以強(qiáng)有力地激活枯否細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。LPS刺激枯否細(xì)胞使其產(chǎn)生并分泌炎性細(xì)胞因子如:TNF-α、IL-1β、IL-6等，其分泌依賴于MAPK和NF-κB信號(hào)通路的激活。這些炎性因子，特別是TNF-α，可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡和壞死。在這個(gè)過程中，枯否細(xì)胞受LPS刺激后激活，在炎癥反應(yīng)中扮演了重要的角色，而肝細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞。D-半乳糖胺作為一種氨基糖，可以誘導(dǎo)體內(nèi)UTP的消耗

4、從而增強(qiáng)LPS的肝臟毒性。利用LPS聯(lián)合D-半乳糖胺(LPS/D-GalN)給小鼠進(jìn)行腹腔注射，可以誘導(dǎo)特異性的肝損傷產(chǎn)生，而對(duì)心、脾、肺等其他器官未造成明顯損傷。因此，LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是目前研究?jī)?nèi)毒素導(dǎo)致的肝損傷的理想動(dòng)物模型。
　　 本實(shí)驗(yàn)的目的是研究PDCD4在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中的作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討。通過本研究的完成，不僅有利于闡明PDCD4在炎癥中的調(diào)控作用，而

5、且為揭示內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制、尋找新的靶點(diǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、PDCD4基因缺失后對(duì)急性肝損傷的影響
　　 以Pdcd-/-4小鼠為實(shí)驗(yàn)組，以同系且同齡的野生型C57BL/6小鼠為對(duì)照組，采用50μg/kgLPS及800mg/kgD-GalN腹腔注射建立內(nèi)毒素性急性肝損傷動(dòng)物模型。分別在建模后0小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)獲得血清和肝臟標(biāo)本進(jìn)行以下各指標(biāo)的檢測(cè)。
　　 1.觀察實(shí)

6、驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠肝臟大體觀，檢測(cè)兩組小鼠肝重和體重的比值變化。
　　 2.利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)兩組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量。
　　 3.利用HE染色做病理學(xué)檢測(cè)，并利用破碎DNA的原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒檢測(cè)凋亡肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
　　 4.利用免疫組化染色（immunohistochemistry，IHC）及westernblot檢測(cè)兩組小鼠肝組織中caspase

7、-3的表達(dá)情況。
　　 二、PDCD4基因缺失后對(duì)小鼠體內(nèi)炎性因子水平的影響
　　 1.利用BD流式細(xì)胞因子微球組合試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10、IL-12p70的含量，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中IL-1β的含量。
　　 2.利用RT-PCR的方法檢測(cè)肝組織中各種炎性因子(Tnfa、Il1b、Il6、Mcp1、Il10、Il12p40

8、、Il12p35)mRNA的水平。
　　 三、PDCD4基因缺失后對(duì)炎癥信號(hào)通路活化的影響
　　 1.利用westernblot的方法檢測(cè)兩組小鼠肝組織中炎癥信號(hào)通路MAPK的活化情況。
　　 2.利用westernblot和IHC的方法檢測(cè)兩組小鼠肝組織中炎癥信號(hào)通路NF-κB的活化情況。
　　 四、體外檢測(cè)PDCD4基因缺失后對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響
　　 分離Pdcd-/-4小鼠及同系且同齡

9、的野生型C57BL/6小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，在體外利用LPS刺激，分別在刺激后0小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)收集其培養(yǎng)上清和巨噬細(xì)胞蛋白進(jìn)行以下各指標(biāo)的檢測(cè)。
　　 1.利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF-α及IL-6的含量。
　　 2.利用westernblot的方法檢測(cè)兩組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中兩條主要的炎癥信號(hào)通路MAPK和NF-κB的活化情況。
　　 結(jié)果：
　　 一、在脂多糖/D-半乳糖胺

10、誘導(dǎo)的急性肝損傷中PDCD4的缺失加重肝細(xì)胞的凋亡和壞死程度
　　 1.肝臟大體形態(tài)顯示與對(duì)照組小鼠相比，建模后5小時(shí)，Pdcd-/-小鼠肝臟腫脹更為明顯，并呈現(xiàn)紫黑色，肝臟與體重的比值明顯高于對(duì)照組小鼠;
　　 2.建模后5小時(shí)，Pdcd-/-4小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量顯著高于對(duì)照組小鼠;
　　 3.建模后5小時(shí)，H&E染色結(jié)果顯示與對(duì)照組小鼠相比，Pdc-/-4小鼠的肝組織小葉

11、正常結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)片狀出血壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn);
　　 4.肝組織切片的TUNEL染色顯示，誘導(dǎo)肝損傷后5小時(shí)，Pdcd-/-4小鼠肝臟細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組小鼠。肝組織切片caspase-3免疫組化染色和肝組織蛋白westernblot結(jié)果進(jìn)一步顯示，建模后5小時(shí)，Pdc-/-4小鼠肝組織caspase-3活化程度顯著高于對(duì)照組小鼠。
　　 二、在脂多糖/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷中PDCD4的缺失導(dǎo)

12、致血清及肝臟局部某些炎性細(xì)胞因子的水平增加
　　 1.建模后3小時(shí)，Pdcd-/-4小鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1水平顯著高于對(duì)照組小鼠;
　　 2.建模后3小時(shí)，Pdcd-/-4小鼠肝臟組織中Tnfa，Il1b，Il6和Mcp1mRNA水平顯著高于對(duì)照組小鼠。
　　 三、PDCD4的缺失促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的肝臟內(nèi)MAPK和NF-κB通路的活化
　　 1.建模后3小時(shí)，Pdcd-/-4小鼠

13、肝臟組織中p-JNK的水平顯著高于對(duì)照組小鼠，建模后5小時(shí)，Pdcd-/-4小鼠肝臟組織中p-ERK、p-P38水平都顯著高于對(duì)照組小鼠;
　　 2.建模后3小時(shí)和5小時(shí)，Pdcd-/-4小鼠肝臟組織中p-P65的水平顯著高于對(duì)照組小鼠。
　　 四、PDCD4基因缺失后增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞活化
　　 1.在LPS刺激3小時(shí)和5小時(shí)后，Pdcd-/-4小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞上清中TNF-α顯著高于對(duì)照組小鼠，在

14、LPS刺激5小時(shí)后，Pdcd-/-4小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞上清中IL-6顯著高于對(duì)照組小鼠。
　　 2.LPS刺激3小時(shí)后，Pdcd-/-4小鼠的巨噬細(xì)胞中磷酸化的P38，ERK表達(dá)顯著增加，LPS刺激5小時(shí)后，Pdcd-/-4小鼠的巨噬細(xì)胞中磷酸化的JNK表達(dá)顯著增加;
　　 3.LPS刺激3小時(shí)和5小時(shí)后，Pdcd-/-4小鼠巨噬細(xì)胞中磷酸化的P65水平明顯高于對(duì)照組小鼠。
　　 結(jié)論及意義：
　　 以上