NOD1-RIP2信號通路對巨噬細(xì)胞炎性活化的調(diào)控.pdf

1、目的:本研究以人單核細(xì)胞株THP-1為基礎(chǔ)，觀察NOD1/RIP2信號通路對巨噬細(xì)胞炎性活化以及表型變化的影響，探討NOD1/RIP2信號通路在動脈粥樣硬化形成和發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　方法:分別用不同濃度(10、25、50mg/L)的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞中24 h，以50 mg/L濃度的ox-LDL分別刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞(8、16、24 h)，以空白組作為對照。應(yīng)用熒光實(shí)時定量PCR

2、檢測THP-1源性巨噬細(xì)胞中NOD1、RIP2 mRNA表達(dá);應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞中NOD1、RIP2蛋白表達(dá);應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞腫瘤壞事因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的分泌。設(shè)計(jì)3對RIP2 siRNA，應(yīng)用hiperfict轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染RIP2 siRNA進(jìn)入細(xì)胞。應(yīng)用熒光實(shí)時定量PCR檢測THP-1源性巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染后RIP2 mRNA的表達(dá);應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后

3、RIP2蛋白的表達(dá)，從而篩選最適siRNA轉(zhuǎn)染濃度和最有效的一對siRNA。用最有效RIP2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，50 mg/L ox-LDL處理24 h。應(yīng)用ELISA檢測TNF-α、MCP-1的分泌;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原CD86表達(dá);熒光實(shí)時定量PCR檢測細(xì)胞白細(xì)胞介素10(IL-10)、白細(xì)胞介素12(IL-12)mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:ox-LDL能以劑量依賴和時間依賴的方式誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NOD1/RIP2

4、信號通路的表達(dá)，隨著ox-LDL刺激濃度的增加，NOD1 mRNA的表達(dá)增加(對照組:1±0;10mg/L組:2.32±0.7;25 mg/L組:4.37±1.36;50mg/L組:15.6±1.95, P＜0.01);同樣RIP2 mRNA的表達(dá)也增加(對照組:1±0;10mg/L組:3.45±0.98;25 mg/L組:7.62±0.92;50mg/L組:10.21±1.13, P＜0.01); NOD1蛋白和RIP2蛋白的表達(dá)也隨

5、ox-LDL刺激濃度的增加而增加，分別為NOD1蛋白(對照組:0.14±0.01;10mg/L組:0.30±0.03;25 mg/L組:0.93±0.03;50mg/L組:1.26±0.05, P＜0.01);RIP2蛋白(對照組:0.2±0.02;10mg/L組:0.21±0.01;25 mg/L組:0.85±0.07;50mg/L組:1.52±0.09, P＜0.01)。隨著ox-LDL刺激時間的增加，NOD1 mRNA的表達(dá)增加(

6、對照組:1±0;8h組:7.39±1.59;16 h組:11.2±2.51;24h組:16.1±3.59,P＜0.01);同樣RIP2mRNA的表達(dá)也增加(對照組:1±0;8h組:1.46±0.29;16 h組:2.54±0.37;24 h組:4.27±0.69, P＜0.01)。NOD1蛋白和RIP2蛋白的相對表達(dá)量也隨ox-LDL刺激時間的延長而增加，分別為NOD1蛋白(對照組:0.41±0.03;8h組:1.63±0.12;16

7、h組:2.27±0.11;24h組:2.86±0.15, P＜0.01); RIP2蛋白(對照組:0.39±0.03;8h組:1.23±0.14;16 h組:4.42±0.28;24 h組:5.93±0.64,P＜0.01)。ELISA結(jié)果顯示隨著ox-LDL刺激濃度的增加，TNF-α(對照組:18.51±0.77 pg/mL;10mg/L組:24.71±2.47 pg/mL;25 mg/L組:30.64±1.96 pg/mL;50mg

8、/L組:71.53±2.35 pg/mL, P＜0.01)和MCP-1(對照組:49.11±4.03 pg/mL;10mg/L組:108.5±4.96 pg/mL;25 mg/L組:127.91±4.13 pg/mL;50mg/L組:163.4±7.22pg/mL, P＜0.01)的表達(dá)升高;隨著刺激時間的延長，TNF-α(對照組:18.51±0.77pg/mL;8 h組:27.01±0.95 pg/mL;16 h組:44.71±2.0

9、6 pg/mL;24 h組:71.53±2.35 pg/mL, P＜0.01)和MCP-1(對照組:49.11±4.03 pg/mL;8 h組:74.51±3.92 pg/mL;16h組:77.76±7.24 pg/mL;24 h組:163.4±7.22 pg/mL, P＜0.01)的表達(dá)升高。以不同濃度siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示50 nmol/L的siRNA基因沉默效應(yīng)最明顯(0.22±0.08 vs.1±0，P＜

10、0.01)。選取50 nmol/L作為實(shí)驗(yàn)濃度，轉(zhuǎn)染3對siRNA,用Western blot法檢測各組蛋白表達(dá)，選出了最有效的一對siRNA(0.38±0.05 vs.2.22±0.08, P＜0.01)。以最有效RIP2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，ox-LDL處理24 h。ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，50 mg/L ox-LDL刺激組顯著增加炎癥因子TNF-α和MCP-1的分泌(分別為30.68±1.31 pg/mL vs.1

11、2.77±0.68 pg/mL;53.42±2.99 pg/mL vs.18.06±2.11 pg/mL,P均＜0.01);與ox-LDL刺激組相比，RIP2 siRNA轉(zhuǎn)染后ox-LDL刺激組炎癥因子的分泌顯著下降(分別為19.31±1.65 pg/mL vs.30.68±1.31 pg/mL;28.62±0.88 pg/mL vs.53.42±2.99 pg/mL,P均＜0.01)。流式細(xì)胞術(shù)和熒光定量PCR結(jié)果顯示，與較對照組相比

12、，50 mg/L ox-LDL刺激組表面抗原CD86(7605.74±61.27 vs.11538.47±179.35, P＜0.01)、IL-12(0.3±0.07 vs.1±0,P＜0.01)的表達(dá)減少;IL-10(4.26±0.22 vs.1±0，P＜0.01)的表達(dá)升高。與ox-LDL刺激組相比，RIP2 siRNA轉(zhuǎn)染后ox-LDL刺激組CD86(7590.99±63.96 vs.7605.74±61.27，P＞0.05)、I