豬ATF4基因遺傳多態(tài)性及啟動子區(qū)域研究.pdf

1、脂肪是人和動物體內必須的營養(yǎng)成分,也是構成生物體的重要組分,其代謝調控受眾多因素的影響,主要包括遺傳因素、營養(yǎng)水平、環(huán)境因素等,它們形成復雜的調控網絡共同調節(jié)脂肪的代謝。豬作為人類動物蛋白的重要來源,其體內脂肪的過度沉積直接影響瘦肉率的提高,因此尋找影響脂肪代謝的主效基因成為當前動物遺傳育種專家研究的熱點。
　　 ATF4(activating transcription factor4)即激活轉錄因子4屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白家

2、族。最近的研究發(fā)現(xiàn)其與脂肪的代謝和能量消耗有關,鑒于其在脂肪代謝中的重要作用,而在豬中的研究報道較少,本文選取其作為影響豬脂肪性狀的候選基因進行研究,探討瘦肉型和脂肪型豬差異形成的分子機制,為從分子水平上培育瘦肉率高肉質好的豬種提供理論依據(jù)。
　　 本實驗對ATF4基因進行克隆,遺傳效應分析和表達模式分析,取得了如下結果:
　　 1.克隆了大白豬和梅山豬ATF4基因的CDS序列,通過測序、酶切驗證發(fā)現(xiàn)在翻譯起始密碼子AT

3、G下游159bp處存在A159G轉換。
　　 2.對大白豬、長白豬、梅山豬、通城豬和大白豬×梅山豬F2進行了AluⅠ-RFLP分析,并對大白豬×梅山豬的F2群體195個體與生產性狀進行關聯(lián)分析,結果表明,ATF4的多態(tài)性與臀部平均膘厚存在極顯著相關(P<0.01),與胸腰椎間膘厚、平均膘厚、眼肌高、眼肌面積存在顯著相關(P<0.05)。
　　 3.通過RT-PCR方法對ATF4基因在心、肝、脾、肺、腎、胃等11個組織中的

4、表達量進行定量分析,發(fā)現(xiàn)ATF4基因在肌肉中表達量較高。
　　 4.以背最長肌為材料,對ATF4基因在大白豬和梅山豬不同發(fā)育階段的表達情況進行了定量分析,發(fā)現(xiàn)在胚胎期65d、出生后3d在大白豬和梅山豬中基因表達量較低,兩個品種之間沒有明顯的差異,在60d和120d時期基因表達量均增加,但是梅山豬表達量顯著高于大白豬。
　　 5.通過PCR技術擴增出ATF4基因啟動子序列2007bp,并利用生物信息學在線軟件對啟動子區(qū)域的

5、順式作用元件和轉錄結合位點進行了預測,根據(jù)預測的結果設計缺失引物,構建了7個含有不同長度啟動子缺失片段的雙螢光素酶報告基因表達載體。
　　 6.將構建7個缺失片段重組質粒瞬時轉染PK-15和C2C12細胞,檢測雙螢光素酶的相對活性,結果構建的載體都具有活性,其中pGL3-1280的相對活性最高在C2C12細胞中,為進一步鑒定ATF4基因的轉錄調控機制奠定實驗基礎。
　　 7.對大白豬和梅山豬啟動子區(qū)域進行序列比對發(fā)現(xiàn)存在

6、11處潛在的SNP位點和插入觖失,對其中一處20bp的缺失進行了驗證發(fā)現(xiàn),在梅山豬中為缺失型,在大白豬為插入型。
　　 8.在ATG上游2540bp和2570bp處測序發(fā)現(xiàn)存在一個5bp的缺失(TCTTA)和堿基突變(C/T),其中2570bp處堿基轉換可以被BstⅪ酶識別,進行了BstⅪ-RFLP分析,結果發(fā)現(xiàn)檢查的梅山豬均為TT型,大白豬均為CC型,對136頭F2進行酶切分型。
　　 9.克隆豬ATF4基因CDS,構