HuVEGF-,121-基因修飾復(fù)合材料修復(fù)兔橈骨火器性骨缺損的實驗研究.pdf

1、骨缺損是戰(zhàn)爭中常見的損傷,可由子彈、爆炸物碎片、沖擊波或爆炸直接損傷等因素所引起.由于創(chuàng)傷嚴(yán)重、易于感染等特點,如果未能得到及時修復(fù)或修復(fù)不佳,將導(dǎo)致骨不連、骨延遲愈合等,給病患者帶來疼痛和功能喪失.針對骨缺損的治療,目前的主要手段是采取自體骨移植,但由于供體的缺乏及重新造成的損傷而限制了其廣泛運用.雖然異體或異種骨移植避免了自體骨移植的不足,但會帶來肝炎等疾病的傳播.同時,戰(zhàn)爭時常在短時間出現(xiàn)大批傷員,異體骨的來源也是一個棘手的問題.

2、近年來,組織工程化人工骨成為很有希望的骨組織替代品.其核心成分主要包括支架材料、種子細(xì)胞和誘導(dǎo)信號.盡管相關(guān)的研究顯示許多令人鼓舞的進(jìn)展和希望,但由于火器性損傷的特殊性,損傷局部有血循環(huán)差、易感染等特點,目前的人工骨尚不能達(dá)到與自體骨移植相似的效果.為此該課題引入基因轉(zhuǎn)染技術(shù),用人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子121(human Vascular Endothelial Growth Factor 121, huVEGF<,121>)基因?qū)ε囵B(yǎng)的

3、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stem cell,BMSCs)進(jìn)行基因修飾,增加其合成及分泌成血管因子的水平,然后用huVEGF<,121>基因修飾的BMSCs與聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物制作的多孔支架材料結(jié)合,構(gòu)建huVEGF<,121>基因修飾復(fù)合材料,用于修復(fù)家兔橈骨火器性骨缺損,探討火器性骨缺損治療的替代方法及策略.該課題的研究主要包括以下三個部分,所取得的主要結(jié)果及結(jié)論如下:第一部分家兔橈骨火器傷性骨缺損動物模型的建立

4、及其局部血流灌注變化1、該研究首先用53式滑膛槍發(fā)射0.25g鋼珠,探討在射擊距離5米情況下,制作家兔橈骨火器性骨缺損的適當(dāng)條件,為下一步探討其損傷特點和修復(fù)策略提供基礎(chǔ).結(jié)果表明,當(dāng)投射物初速為550~600m/s時,雙骨折發(fā)生率低,骨折粉碎范圍在1.0cm左右,經(jīng)清創(chuàng)后骨缺損約為1.2cm,動物能長期存活,符合下一步研究的需要.2、在此基礎(chǔ)上,我們用印度墨汁灌注的方法觀察了火器性骨缺損局部骨和肌肉不同時相點的血流灌注情況,結(jié)果表明,

5、火器性骨缺損局部的骨折端和肌肉的血流灌注都明顯減少.結(jié)果提示,在研究火器性骨缺損的修復(fù)時,改善血流灌注具有重要意義.第二部分 攜帶huVEGF<,121>基因的重組腺病毒載體構(gòu)建1、用酶切法和測序法鑒定了Puc18-huVEGF<,121>,保證了外源基因序列的正確性.2、分別構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒Pdc315-huVEGF<,121>和帶有報告基因的穿梭質(zhì)粒Pdc315-VEGF<,121>-Egfp,分別用兩種穿梭質(zhì)粒與腺病毒基因組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)

6、染293細(xì)胞,獲得兩種重組腺病毒Ad-huVEGF<,121>和Ad-huVEGF<,121>-Egfp.3、采用PCR鑒定了兩種重組腺病毒帶有外源基因,空斑試驗測定病毒液的滴度分別為1.0×10<'10>~3.0×10<'11>pfu/ml和3.0×10<'10>~4.2×10<'11>pfu/ml.4、用免疫組化法證明Ad-huVEGF<,121>轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞能合成huVEGF<,121>蛋白.熒光顯微鏡觀察表明Ad-huVEG

7、F<,121>-Egfp轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞能合成huVEGF<,121>-Egfp融合蛋白.以上結(jié)果表明,我們構(gòu)建的重組腺病毒載體含有目的基因,序列完整,閱讀框架正確,效價高,能在真核細(xì)胞中表達(dá),適用于基因治療.第三部分 huVEGF<,121>基因修飾復(fù)合材料的構(gòu)建1、用密度梯度離心法分離并培養(yǎng)BMSCs,用條件培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化,表明該細(xì)胞是具有多向分化潛能的干細(xì)胞2、用Ad-huVEGF<,121>-Egfp、A

8、d-huVEGF<,121>和Ad-lacZ分別轉(zhuǎn)染BMSCs,研究了病毒轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化、貼壁等生物特性的影響,結(jié)果表明,3種病毒轉(zhuǎn)染對BMSCs的增殖、誘導(dǎo)分化、貼壁等生物學(xué)特性沒有影響.3、用融媒溶解、顆粒濾取法制作了孔徑在250-450um的PLGA多孔支架材料,測定孔隙率為86﹪左右.體外生物相容性研究表明,BMSCs能和該材料粘附,電鏡下觀察見細(xì)胞伸展良好.體內(nèi)研究表明,該支架材料肌肉包埋條件下,早期誘發(fā)輕度非特異性

9、炎癥反應(yīng),2周時明顯消退,說明該材料生物相容性良好.4、用Ad-huVEGF<,121>-Egfp轉(zhuǎn)染BMSCs,再將此細(xì)胞與多孔支架材料復(fù)合后植入體內(nèi),結(jié)果表明,外源基因在體內(nèi)3周時明顯減弱.5、用Ad-huVEGF<,121>-Egfp轉(zhuǎn)染骨BMSCs,體外培養(yǎng)4周后仍可見細(xì)胞內(nèi)明顯的綠色熒光.6、流式細(xì)胞儀測定表明,用Ad-huVEGF<,121>-Egfp轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染效率高,達(dá)到97.5﹪.以上結(jié)果表明,BMSCs具有成

10、骨分化等多向分化潛能,適于基因轉(zhuǎn)染,與支架材料生物相容性好.我們構(gòu)建的腺病毒載體對細(xì)胞的生物學(xué)特性沒有明顯的影響.外源基因轉(zhuǎn)染BMSCs后,能在體內(nèi)外表達(dá)一定的時間,適用于體內(nèi)的修復(fù)研究.第四部分huVEGF<,121>基因修飾復(fù)合材料修復(fù)家兔橈骨火器性骨缺損的實驗應(yīng)用體外獲取的huVEGF<,121>基因修飾的BMSCs,結(jié)合PLGA多孔支架構(gòu)建huVEGF<,121>基因修飾的人工復(fù)合材料,通過該材料修復(fù)兔橈骨火器性骨缺損,并與修復(fù)

11、手術(shù)制作的橈骨骨缺損進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn):1. 修復(fù)局部血流量和血流灌注:無論是手術(shù)骨缺損組還是火器性骨缺損組,huVEGF<,121>基因轉(zhuǎn)染都能提高局部的血流量和血流灌注,但兩者具有不同的特點:在手術(shù)骨缺損組(S組,下同),轉(zhuǎn)染huVEGF<,121>基因組(SD亞組,下同)只在修復(fù)后72h和2周兩個時相點局部血流量和血流灌注明顯高于單純支架材料組(SA亞組,下同)、支架材料加單純細(xì)胞組(SB亞組,下同)以及支架材料加Ad-lacZ轉(zhuǎn)

12、染細(xì)胞組(SC亞組,下同),而SA、SB和SC亞組間沒有顯著差異.其他時相點四個亞組間沒有顯著差異.而在火器性骨缺損組(F組,下同),在修復(fù)后72h時及其以后各個時相點,huVEGF<,121>基因轉(zhuǎn)染組(FD亞組,下同)的血流量和血流灌注均明顯高于單純支架材料組(FA亞組,下同)、支架材料加單純細(xì)胞組(FB亞組,下同)以及支架材料加Ad-lacZ轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(FC亞組,下同),而各個時相點FA、FB和FC亞組間沒有顯著差異.2. X線檢

13、查結(jié)果和組織學(xué)觀察:在S組中,無論是新骨生成面積還是骨痂的灰度值,在各個時相點,SB、SC和SD亞組間均沒有顯著性差異.而在修復(fù)后8周及其以后各時相點,無論是新骨生成面積還是骨痂的灰度值, SB、SC和SD三個亞組均顯著高于SA亞組,說明在S組,huVEGF<,121>基因轉(zhuǎn)染并不能加快骨缺損的修復(fù),影響骨缺損修復(fù)的決定因素是BMSCs的有無.但在F組,在修復(fù)后8周及其以后各個時相點,無論是新骨生成面積還是骨痂的灰度值, FD亞組顯著高

14、于FC和FB亞組, FC和FB亞組又顯著高于FA組,而FC和FB亞組間沒有顯著性差異,說明huVEGF<,121>基因轉(zhuǎn)染和BMSCs對骨缺損的修復(fù)都有影響.3. 生物力學(xué)測定:與組織學(xué)檢查相似,在S組, 隨著時間延長,四組動物力學(xué)比值持續(xù)下降(力學(xué)比值越小,力學(xué)強度越高,詳見正文).在各個時相點,SB、SC和SD三個亞組均顯著低于SA亞組,而SB、SC和SD亞組間均沒有顯著性差異.但在F組,在修復(fù)后8周及其以后各個時相點, FD亞組顯