膿毒癥時(shí)細(xì)菌內(nèi)毒素通過自分泌ATP-P2X1-Ca2+通路對中性粒細(xì)胞趨化的抑制作用及機(jī)制.pdf

1、背景：膿毒癥是指宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)，產(chǎn)生危及生命的器官功能障礙，是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克后常見的并發(fā)癥。近年來，盡管在嚴(yán)重膿毒癥及膿毒性休克的抗感染、液體復(fù)蘇、創(chuàng)面處理、器官支持治療等方面已取得進(jìn)展，但其病死率仍居高不下，是重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)病人的首要死亡原因。膿毒癥患者免疫功能受到抑制，自身清除感染的能力降低，是患者感染難以控制的重要原因?？股氐氖褂锰岣吡四摱景Y患者的救治成功率，但隨著抗生素

2、的長期應(yīng)用，不敏感菌株大量繁殖，抗生素不能完全解決膿毒癥時(shí)的感染問題。因此，如何改善膿毒癥時(shí)患者自身的免疫功能從而有效地控制感染，是膿毒癥防治的重要課題。膿毒癥時(shí)，在多種細(xì)菌毒素及細(xì)胞因子的刺激下，中性粒細(xì)胞功能失調(diào)，趨化方向性受損，到達(dá)病原感染部位的中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，不能有效抑制病原增殖，導(dǎo)致機(jī)體抵御感染的能力降低，影響重要臟器的功能，是膿毒癥患者死亡的重要原因之一。進(jìn)一步闡明膿毒癥時(shí)中性粒細(xì)胞方向性受損的機(jī)制，尋找針對性的干預(yù)措施

3、，使中性粒細(xì)胞向感染部位的趨化增強(qiáng)，可為膿毒癥的抗感染治療提供理論基礎(chǔ)。
　　內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁表面的主要組成成分，過量的LPS可導(dǎo)致天然免疫細(xì)胞的過度活化，釋放過多的炎癥介質(zhì)，通過自分泌、旁分泌和體循環(huán)作用于全身組織器官，是引起膿毒癥時(shí)全身炎癥反應(yīng)綜合征的重要原因。ATP是細(xì)胞內(nèi)重要的能量分子，近年來，Junger等人發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞也可通過自分泌ATP途徑對自身的趨

4、化產(chǎn)生影響。中性粒細(xì)胞趨化時(shí)前端片足分泌的ATP通過自分泌途徑激活自身局部的P2Y2受體，增強(qiáng)了細(xì)胞的運(yùn)動功能，但當(dāng)細(xì)胞整體都接受ATP的刺激時(shí)，中性粒細(xì)胞的趨化功能反而受到抑制，這提示胞外ATP亦可能是中性粒細(xì)胞趨化的抑制分子，但其具體分子機(jī)制目前并不明確。P2X1受體是ATP門控陽離子通道受體，與ATP結(jié)合后能迅速誘導(dǎo)細(xì)胞的Ca+內(nèi)流，是細(xì)胞重要的Ca2+內(nèi)流通道。近年來的研究證實(shí)P2X1受體也表達(dá)于外周血中性粒細(xì)胞中，ATP可通過

5、活化P2X1受體增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動，但隨機(jī)運(yùn)動的中性粒細(xì)胞不具有方向性，損傷了其向趨化物的定向運(yùn)動能力，減弱了中性粒細(xì)胞向感染部位的特異性趨化能力。Ca+是細(xì)胞內(nèi)重要的信號分子，參與調(diào)控了中性粒細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，但過度的Ca2+內(nèi)流對中性粒細(xì)胞的趨化則具有抑制作用，但其是否與P2X1受體的活化有關(guān)目前尚不明確。
　　方法：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用致死劑量和非致死劑量的大腸埃希菌腹腔注射，制作膿毒癥感染小鼠模型和輕度局部感染小鼠模型，

6、觀察小鼠生存率，血細(xì)胞自動分析儀檢測腹腔灌洗液、血液中性粒細(xì)胞數(shù)量，平板菌落計(jì)數(shù)法檢測腹腔灌洗液、血液細(xì)菌含量。病理切片HE染色觀察小鼠膿毒癥后肝、肺損傷，ELISA試劑盒檢測肝、肺IL-1β、IL-6細(xì)胞因子水平，MDA試劑盒檢測肝、肺MDA含量，轉(zhuǎn)錄譜基因芯片檢測中性粒細(xì)胞基因表達(dá)的差異。
　　體外實(shí)驗(yàn)采用LPS刺激原代中性粒細(xì)胞模型，瓊脂糖趨化實(shí)驗(yàn)檢測中性粒細(xì)胞趨化距離，流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞趨化分子受體表達(dá)及凋亡，高效液

7、相色譜儀檢測ATP釋放，Western Blot檢測Cx43蛋白磷酸化，激光共聚焦顯微鏡檢測P2X1受體分布、Ca2+內(nèi)流，原子力顯微鏡、場發(fā)射掃描電子顯微鏡檢測中性粒細(xì)胞極性化，激光共聚焦顯微鏡檢測骨架蛋白肌球蛋白輕鏈(myosin lightchain，MLC)磷酸化、極性化。
　　采用CRISPR/Cas9慢病毒敲除HL-60早幼粒細(xì)胞株P(guān)2X1受體，1.3％二甲基亞砜處理HL-60細(xì)胞6d后分化成類中性粒細(xì)胞，原子力顯微鏡

8、、場發(fā)射掃描電子顯微鏡檢測中性粒細(xì)胞極性化，激光共聚焦顯微鏡檢測骨架蛋白MLC磷酸化、極性化。
　　結(jié)果：體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時(shí)中性粒細(xì)胞趨化功能受到抑制、清除感染能力受損，肝、肺組織病理損傷明顯、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)一步的基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)膿毒癥時(shí)中性粒細(xì)胞TLR信號通路活化，LPS通過TLR4對中性粒細(xì)胞多種的趨化分子受體的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用。
　　體外研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥時(shí)重要的炎癥刺激分子中LPS對中性粒細(xì)胞趨化的抑制作用最為明顯

9、，LPS通過促進(jìn)Cx43通道開放分泌ATP，ATP作用于自身P2X1受體后引起過量的Ca2+內(nèi)流，使中性粒細(xì)胞鈣調(diào)蛋白MLCK活化，導(dǎo)致MLC異常磷酸化及極性化，抑制了中性粒細(xì)胞的趨化。P2X1受體敲除后，LPS對中性粒細(xì)胞的抑制作用被削弱，MLC磷酸化、極性化恢復(fù)正常。
　　結(jié)論：本研究通過體內(nèi)、體外研究發(fā)現(xiàn)了LPS刺激后自分泌ATP/P2X1/Ca2+信號通路對中性粒細(xì)胞趨化的抑制作用，并揭示其對中性粒細(xì)胞骨架蛋白MLC異常極