膿毒癥時細菌內毒素通過自分泌ATP-P2X1-Ca2+通路對中性粒細胞趨化的抑制作用及機制.pdf

1、背景：膿毒癥是指宿主對感染的反應失調，產(chǎn)生危及生命的器官功能障礙，是嚴重創(chuàng)傷、燒傷、休克后常見的并發(fā)癥。近年來，盡管在嚴重膿毒癥及膿毒性休克的抗感染、液體復蘇、創(chuàng)面處理、器官支持治療等方面已取得進展，但其病死率仍居高不下，是重癥監(jiān)護室(intensive care unit，ICU)病人的首要死亡原因。膿毒癥患者免疫功能受到抑制，自身清除感染的能力降低，是患者感染難以控制的重要原因?？股氐氖褂锰岣吡四摱景Y患者的救治成功率，但隨著抗生素

2、的長期應用，不敏感菌株大量繁殖，抗生素不能完全解決膿毒癥時的感染問題。因此，如何改善膿毒癥時患者自身的免疫功能從而有效地控制感染，是膿毒癥防治的重要課題。膿毒癥時，在多種細菌毒素及細胞因子的刺激下，中性粒細胞功能失調，趨化方向性受損，到達病原感染部位的中性粒細胞數(shù)量減少，不能有效抑制病原增殖，導致機體抵御感染的能力降低，影響重要臟器的功能，是膿毒癥患者死亡的重要原因之一。進一步闡明膿毒癥時中性粒細胞方向性受損的機制，尋找針對性的干預措施

3、，使中性粒細胞向感染部位的趨化增強，可為膿毒癥的抗感染治療提供理論基礎。
　　內毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁表面的主要組成成分，過量的LPS可導致天然免疫細胞的過度活化，釋放過多的炎癥介質，通過自分泌、旁分泌和體循環(huán)作用于全身組織器官，是引起膿毒癥時全身炎癥反應綜合征的重要原因。ATP是細胞內重要的能量分子，近年來，Junger等人發(fā)現(xiàn)中性粒細胞也可通過自分泌ATP途徑對自身的趨

4、化產(chǎn)生影響。中性粒細胞趨化時前端片足分泌的ATP通過自分泌途徑激活自身局部的P2Y2受體，增強了細胞的運動功能，但當細胞整體都接受ATP的刺激時，中性粒細胞的趨化功能反而受到抑制，這提示胞外ATP亦可能是中性粒細胞趨化的抑制分子，但其具體分子機制目前并不明確。P2X1受體是ATP門控陽離子通道受體，與ATP結合后能迅速誘導細胞的Ca+內流，是細胞重要的Ca2+內流通道。近年來的研究證實P2X1受體也表達于外周血中性粒細胞中，ATP可通過

5、活化P2X1受體增強中性粒細胞的隨機運動，但隨機運動的中性粒細胞不具有方向性，損傷了其向趨化物的定向運動能力，減弱了中性粒細胞向感染部位的特異性趨化能力。Ca+是細胞內重要的信號分子，參與調控了中性粒細胞的多種生物學功能，但過度的Ca2+內流對中性粒細胞的趨化則具有抑制作用，但其是否與P2X1受體的活化有關目前尚不明確。
　　方法：體內實驗采用致死劑量和非致死劑量的大腸埃希菌腹腔注射，制作膿毒癥感染小鼠模型和輕度局部感染小鼠模型，

6、觀察小鼠生存率，血細胞自動分析儀檢測腹腔灌洗液、血液中性粒細胞數(shù)量，平板菌落計數(shù)法檢測腹腔灌洗液、血液細菌含量。病理切片HE染色觀察小鼠膿毒癥后肝、肺損傷，ELISA試劑盒檢測肝、肺IL-1β、IL-6細胞因子水平，MDA試劑盒檢測肝、肺MDA含量，轉錄譜基因芯片檢測中性粒細胞基因表達的差異。
　　體外實驗采用LPS刺激原代中性粒細胞模型，瓊脂糖趨化實驗檢測中性粒細胞趨化距離，流式細胞儀檢測中性粒細胞趨化分子受體表達及凋亡，高效液

7、相色譜儀檢測ATP釋放，Western Blot檢測Cx43蛋白磷酸化，激光共聚焦顯微鏡檢測P2X1受體分布、Ca2+內流，原子力顯微鏡、場發(fā)射掃描電子顯微鏡檢測中性粒細胞極性化，激光共聚焦顯微鏡檢測骨架蛋白肌球蛋白輕鏈(myosin lightchain，MLC)磷酸化、極性化。
　　采用CRISPR/Cas9慢病毒敲除HL-60早幼粒細胞株P2X1受體，1.3％二甲基亞砜處理HL-60細胞6d后分化成類中性粒細胞，原子力顯微鏡

8、、場發(fā)射掃描電子顯微鏡檢測中性粒細胞極性化，激光共聚焦顯微鏡檢測骨架蛋白MLC磷酸化、極性化。
　　結果：體內研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時中性粒細胞趨化功能受到抑制、清除感染能力受損，肝、肺組織病理損傷明顯、炎癥反應增強，進一步的基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)膿毒癥時中性粒細胞TLR信號通路活化，LPS通過TLR4對中性粒細胞多種的趨化分子受體的表達產(chǎn)生調控作用。
　　體外研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥時重要的炎癥刺激分子中LPS對中性粒細胞趨化的抑制作用最為明顯

9、，LPS通過促進Cx43通道開放分泌ATP，ATP作用于自身P2X1受體后引起過量的Ca2+內流，使中性粒細胞鈣調蛋白MLCK活化，導致MLC異常磷酸化及極性化，抑制了中性粒細胞的趨化。P2X1受體敲除后，LPS對中性粒細胞的抑制作用被削弱，MLC磷酸化、極性化恢復正常。
　　結論：本研究通過體內、體外研究發(fā)現(xiàn)了LPS刺激后自分泌ATP/P2X1/Ca2+信號通路對中性粒細胞趨化的抑制作用，并揭示其對中性粒細胞骨架蛋白MLC異常極