實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)、外源IGF-Ⅰ表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　興奮劑問(wèn)題一直以來(lái)都是困擾所有體育賽事的主要問(wèn)題之一，世界反興奮劑機(jī)構(gòu)禁止在一切運(yùn)動(dòng)賽事中使用興奮劑。然而對(duì)于興奮劑的有效檢測(cè)卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于興奮劑的研發(fā)與使用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究基因興奮劑 IGF-Ⅰ，建立一種檢測(cè)區(qū)分內(nèi)、外源基因表達(dá)的方法，為基因興奮劑的有效檢測(cè)提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　本實(shí)驗(yàn)采用rAAV2介導(dǎo)IGF-Ⅰ的方法將外源基因注射進(jìn)入小鼠肌肉，用以檢測(cè)區(qū)分內(nèi)、外源基因的表達(dá)情況。研究對(duì)象

2、為30只雄性ICR小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（n=6）、注射3d組（n=6）、注射7d組（n=6）、注射14d組（n=6）、注射30d組（n=6）。構(gòu)建含有目的基因IGF-Ⅰ的質(zhì)粒，并進(jìn)行病毒包裝。在小鼠右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)上方斜行進(jìn)針進(jìn)行病毒注射，每組按照不同的實(shí)驗(yàn)天數(shù)分別提取肌肉和血液中的DNA。通過(guò)在IGF-Ⅰ基因序列外顯子2，3之間設(shè)計(jì)特異性的熒光探針來(lái)識(shí)別外源性IGF-Ⅰ基因，合成ITC基因以及相應(yīng)的ITC探針，作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)部閾值調(diào)控的

3、模版。以肌肉和血液提取得到的樣本DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣本DNA、ITC質(zhì)粒、IGF-Ⅰ目的探針、ITC探針、引物等放在同一體系中反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過(guò)比較IGF-Ⅰ目的探針與ITC探針Ct值的大小，來(lái)排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中外界因素的干擾。通過(guò)比較相應(yīng)組別的Ct值，來(lái)確定IGF-Ⅰ的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel與SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　研究結(jié)果：
　　（1）在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)儀

4、器能夠捕捉到目的探針熒光信號(hào)的積累，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注射的外源性 IGF-Ⅰ在小鼠體內(nèi)得到表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，能夠檢測(cè)到外源基因的表達(dá)。（2）不同時(shí)間獲取肌肉，提取 DNA進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增多Ct值逐漸增大，且3d組與7d組之間Ct值升高明顯，14d組與30d組之間Ct值升高趨于緩慢；不同時(shí)間獲取血液，提取DNA進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增多Ct值變化的趨勢(shì)不明顯，但二者Ct值均小于空白對(duì)照組Ct值。

5、（3）分別以肌肉和血液提取DNA為模版進(jìn)行PCR，在3d，7d組，肌肉DNA的Ct值小于血液DNA的Ct值，兩者之間差異顯著（P<0.01）。14d，30d組，肌肉DNA的Ct值大于血液DNA的Ct值，且兩者之間差異顯著（P<0.01）。（4）以不同取材量肌肉、血液提取 DNA為模版進(jìn)行PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同取材量PCR后的Ct值兩者之間沒(méi)有顯著性的差異（P>0.05）。
　　研究結(jié)論：
　?。?）本實(shí)驗(yàn)建立的方法能有效