三種植物病原細(xì)菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè).pdf

1、萎蔫短小桿菌糖甜菜致病變種(Curtobacterium flaccumfaciens pv．Beticola,cfb)是引起糖甜菜(Beta vulgaris var．saccharifera)葉斑病的主要病原物。依據(jù)該病原菌的16S-23S rRNA ITS區(qū)(登陸號(hào)為AY191513)在特異性位點(diǎn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)引物CfbF(5’-TCAGTGCTGGTCGCCCATFAG-3’)和CfbR(5’-

2、AACAA CGTGCACCAGCCAGC A-3')，預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為191 bp。用該引物擴(kuò)增3個(gè)cfb菌株及29個(gè)參比菌株，僅靶標(biāo)菌擴(kuò)增出191 bp產(chǎn)物；在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系中，靶標(biāo)菌株都檢測(cè)到較強(qiáng)的信號(hào)，熔解曲線為單峰，沒有非特異性擴(kuò)增。為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將靶標(biāo)基因組DNA稀釋為0.001 ng，0.01 ng，0.1 ng，1 ng，10 ng共5個(gè)梯度，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。回歸方程為y=-0.2741x+7.5

3、1，R<'2>=0.99。 菌株Tc7(Pseudomonas spp．)是從發(fā)病糖甜菜上分離到的另一病原細(xì)菌，用16S rRNA通用引物(16sF：5’-ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCT-3’和16sR：5’-TCC CCTACGGTTACCTTGTTA -3’)擴(kuò)增其16S rRNA并測(cè)序，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與Pseudomonas argentinensis、Pseudomonas flavescens、Pseudo

4、monas fulva 等多個(gè)菌株的16S rRNA序列同源性都很高，幾乎不存在特異性位點(diǎn)。用已報(bào)道的真細(xì)菌ITS通用引物U1/U2擴(kuò)增該菌株16S-23S rRNA間的ITS，測(cè)得420 bp序列(已登陸至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為EF205021)，在多態(tài)性較為豐富的區(qū)域設(shè)計(jì)引物PF(5’- AGGCGCTCAAGCAAATCATAGA-3’)和PR(5’-TTGTTCCCAATCACGTAGGGTG -3')，預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)

5、物為238 bp。常規(guī)PCR驗(yàn)證引物特異性，除靶標(biāo)菌株外其余29個(gè)參比菌株均無擴(kuò)增產(chǎn)物。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系中，靶標(biāo)菌株擴(kuò)增曲線平滑，熔解曲線主峰明顯，表明沒有非特異性擴(kuò)增。將靶標(biāo)基因組DNA依次稀釋10倍，成0.00084 ng，0.0084 ng，0.084 ng，0.84 ng，8.4 ng，84 ng共6個(gè)梯度，陰性對(duì)照為滅菌超純水。每個(gè)處理做兩個(gè)重復(fù)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。每?jī)蓚€(gè)重復(fù)的曲線基本重合，Ct值也十分相近，表明重復(fù)性

6、較好。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-3.33x+20.42，R<'2>=0.99。該方法適用于糖甜菜葉片上病原物的檢測(cè)。 茄青枯茵(Ralstonia solanacearum)能夠引起多種重要作物萎蔫癥狀，是一類重要的的病原菌。本研究用J．Schonfeld等人報(bào)道的引物Rsol_fliC建立了對(duì)該菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SYBR Green Ⅰ)檢測(cè)體系，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y= -3.74x+44.15，R<'2>=0.