淀粉樣多肽促進病毒感染的分子機制及其拮抗艾滋病防治藥物抗HIV活性的研究.pdf

1、背景：艾滋病是以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病,自其被發(fā)現(xiàn)以來,已嚴(yán)重威脅人類的生存,對全球人口健康和社會經(jīng)濟的發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響。伴隨著多年來的研究,艾滋病在治療上取得了很大的進展,譬如高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Highly active antiretroviral therapy,HAART,又稱為“雞尾酒”療法)的應(yīng)用。但是,病毒耐藥一直是艾滋病治療的第一大問題,有些患者甚至一開始就對某些藥物耐藥。而艾滋病的預(yù)防,包括HIV

2、疫苗以及殺微生物劑(Microbicides)的研發(fā),更是進展緩慢。一些人體內(nèi)存在的增強病毒感染的因素,如抗體依賴性的病毒增強作用,被認(rèn)為是導(dǎo)致艾滋病疫苗失敗的一大原因。近年來有研究表明精液本身能成數(shù)量級地促進HIV感染,可能是多個殺微生物劑大規(guī)模臨床試驗失敗的原因之一。此外,一些病毒自身的蛋白,比如HIV Nef,也能增強HIV的感染和傳播。正是由于對HIV的傳播和免疫清除機制不甚了解,導(dǎo)致至今仍然沒有成功的HIV疫苗和殺微生物劑可供

3、艾滋病的預(yù)防?，F(xiàn)有的抗艾滋病藥物也不能徹底根治這一疾病。
　　 在本課題組成員的前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)衍生于HIV-1 MN毒株包膜蛋白的病毒與輔助受體結(jié)合的位點的多肽6313和跨膜區(qū)的多肽6380能拮抗HIV融合抑制劑T-20的抗病毒活性,當(dāng)時推測由于T-20能特異與gp120輔助受體結(jié)合區(qū)和gp41跨膜區(qū)結(jié)合,因而具有多靶點的抗HIV融合的機制。然而,進一步研究發(fā)現(xiàn)T-20不能與gp120輔助受體結(jié)合區(qū)或gp41跨膜區(qū)結(jié)合。相

4、反,這區(qū)段的多肽能顯著地促進HIV的感染活性。正是由于這種增強病毒感染的效應(yīng),抵消了T-20的抑制活性。那么gp120其它區(qū)段的多肽也具有增強病毒感染的活性嗎?這些多肽增強病毒感染活性的機制是什么呢?多肽MN-6313能拮抗T-20的抗病毒活性,那么MN-6313也能拮抗其它臨床上使用的抗病毒藥物的抗病毒活性嗎?gp120是裸露在細(xì)胞表面,而且游離的gp120是存在于機體內(nèi)的,在體內(nèi)各種酶、催化抗體存在下,gp120能否水解出這些能增強

5、病毒感染的多肽,從而促進AIDS疾病的病程嗎?對于這些問題的闡明將有助于深入了解艾滋病的發(fā)病機制、疾病進程,并為艾滋病疫苗的開發(fā)和艾滋病輔助治療藥物新靶點的尋找提供依據(jù)。
　　 聯(lián)合國2009年全球艾滋病流行狀況報告顯示,異性間性傳播已成為艾滋病傳播的主要途徑,其比例高達80％,在非洲一些國家更高達90％。在中國性傳播已成為艾滋病的最主要傳播途徑。因此,陰道局部使用的殺微生物劑(microbicide),被認(rèn)為是預(yù)防HIV傳染的

6、有效手段。專家曾預(yù)測,第一代殺微生物劑有望在2010年上市。然而,至今還沒有一個成功的殺微生物劑問世。有6個候選的殺微生物劑已完成Ⅱ/Ⅲ期臨床,試驗結(jié)果都令人失望。其中三個是陰離子多聚物。這類化合物沒有預(yù)防HIV感染的療效,個別還增加HIV感染的機率。
　　 研究發(fā)現(xiàn),精液來源的病毒增強因子(Semen-derived Enhancer of VirusInfection,SEVI)能形成淀粉樣纖維并增強病毒的感染。蛋白聚糖的糖

7、鏈在很多淀粉樣沉積疾病發(fā)揮著重要的作用。鑒于蛋白聚糖的糖鏈與陰離子多聚物類殺微生物劑具有相似的結(jié)構(gòu),陰離子多聚物類殺微生物劑能否與精液來源的病毒增強因子相互作用并促進精液來源的病毒增強因子的形成,成為這類候選殺微生物劑臨床失敗的分子機制呢?
　　 因此本課題擬進行以下兩部分內(nèi)容的探討:(1)衍生于HIV-1gp120淀粉樣多肽促進病毒感染機制的研究。對衍生于X4病毒株HIV-1 MN包膜蛋白的全序列多肽進行掃描,尋找具有增強病毒

8、感染的活性多肽,深入研究這些多肽促進病毒感染的機制；分析淀粉樣多肽對于目前高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療藥物抗病毒藥效的影響;初步探討HIV-1 gp120體外的降解。(2)精液來源的病毒增強因子拮抗陰離子聚合物抗病毒分子機制的研究。擬采用生物物理、生物化學(xué)手段,深入研究陰離子多聚物與精液蛋白的相互作用,探討其對精液蛋白淀粉樣纖維形成的影響,分析精液蛋白降低陰離子多聚物抗HIV活性的分子機制。
　　 第一部分、來源于HIV-1 gp120

9、的淀粉樣多肽促進病毒感染的研究
　　 目的:建立不同嗜性的HIV-1感染性克隆(X4、R5、X4R5受體嗜性的感染克隆)體系,利用衍生于X4病毒株HIV-1 MN包膜蛋白的全序列多肽篩選具有增強病毒感染活性的多肽片段；深入研究這些多肽促進病毒感染的機制,探討這些具有增強病毒感染活性的多肽對當(dāng)前高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)藥物抗病毒藥效的影響；初步研究HIV-1gp120體外的降解及分析降解產(chǎn)物；尋找有效的小分子藥物拮抗包膜

10、蛋白衍生的多肽促進病毒感染的活性。
　　 方法:
　　 1.建立了CCR5,CXCR4,X4R5不同受體嗜性的克隆病毒系統(tǒng),將表達NL4-3(X4受體嗜性的)病毒全長基因的質(zhì)粒,81A(R5受體嗜性的)病毒全長基因的質(zhì)粒和嵌合了NL4-3和81A病毒(雙受體嗜性)全長基因的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,收集的病毒上清液用于多肽對病毒感染的促進作用的研究。利用X4病毒株HIV-1 MN包膜蛋白的全序列多肽篩選具有增強病毒感染

11、活性的多肽片段。利用不同的HIV-1臨床分離株,不同的細(xì)胞感染方式,包括自由病毒感染靶細(xì)胞,病毒在細(xì)胞-細(xì)胞間的傳播來研究與確證篩選出來具有增強病毒感染活性的作用。通過PyMOL軟件分析,多肽序列對比,分析這些HIV-1 gp120來源的具有增強病毒感染多肽的結(jié)構(gòu)特點。XTT毒性實驗研究多肽對于靶細(xì)胞的毒性作用。
　　 2.利用生物化學(xué)、物理化學(xué)、病毒學(xué)的方法對這些具有增強病毒感染多肽的機制進行深入研究。首先利用硫磺素T染色法,

12、透射電子顯微鏡法確證這些具有增強病毒感染的多肽能形成淀粉樣纖維；利用Time-of-addition,eGFP標(biāo)記的假病毒體系結(jié)合細(xì)胞的實驗研究這些具有增強病毒感染的淀粉樣多肽是作用在病毒進入的階段；設(shè)計Virus pull-down assay,cell-binding assay及陰離子多聚物拮抗結(jié)合的實驗研究具有增強病毒感染的淀粉樣多肽是通過結(jié)合病毒和靶細(xì)胞,從而把兩者拉近來促進病毒的感染。
　　 3.選用當(dāng)今臨床應(yīng)用的高

13、效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療藥物,包括進入抑制劑,非/核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等藥物,通過設(shè)立藥物對照組、藥物+多肽組,研究這些藥物在淀粉樣多肽存在下,抗病毒活性的變化。主要討論淀粉樣多肽對臨床抗HIV藥物抗實驗株病毒ⅢB(X4型病毒)和BaL(R5型病毒)感染活性的影響。
　　 4.通過與硫磺素T結(jié)合實驗、剛果紅結(jié)合實驗、透射電鏡等方法分析小分子化合物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對于抑制淀粉樣多肽纖維的形成作用以及打斷

14、成熟的淀粉樣纖維的形態(tài)的作用。利用病毒感染實驗,觀察EGCG拮抗淀粉樣多肽促進病毒感染的作用,分析EGCG是否能恢復(fù)由于淀粉樣多肽存在抗病毒藥物降低的抗病毒活性。
　　 5.建立Western blot方法,追蹤分析體外HIV-1 gp120降解的成分,通過透射電鏡的觀察,探討HIV-1 gp120降解產(chǎn)物形成淀粉樣纖維的可能。
　　 結(jié)果:
　　 1.優(yōu)化實驗條件,在低濃度病毒感染下,利用克隆病毒體系,建立了研

15、究多肽促進病毒感染的病毒系統(tǒng)。
　　 2.從120多條衍生于HIV-1gp120的含15個氨基酸的多肽中,篩選出近1/3的多肽具有增強病毒感染的活性,這些多肽普遍對HIV-1不同受體嗜性的克隆病毒、臨床分離的病毒毒株(包括A、B、C、D亞型的毒株),都有增強病毒感染的活性,也具有促進病毒在細(xì)胞-細(xì)胞間的傳播作用。
　　 3.通過PyMOL軟件分析,多肽序列對比,我們發(fā)現(xiàn)這些具有增強病毒感染活性的多肽來源于HIV-1gp1

16、20的β-折疊結(jié)構(gòu)域,與來源于α-螺旋區(qū)域的多肽比較,增強病毒感染的活性有顯著差異(P＜0.05)。這提示來源于β-折疊結(jié)構(gòu)的多肽更容易促進病毒感染。由于這些增強病毒感染的多肽溶液大多是渾濁的,經(jīng)硫磺素T染色法和透射電子顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)這些促進病毒感染的多肽都能形成淀粉樣纖維。淀粉樣纖維是一種富含β-片層結(jié)構(gòu)的大分子聚合物。
　　 4.這些HIV-1gp120來源的淀粉樣多肽能促進病毒感染的活性是作用在病毒進入階段。Time-o

17、f-addition實驗表明,病毒在結(jié)合細(xì)胞后加入多肽,與病毒在結(jié)合細(xì)胞前加入多肽相比較,多肽對病毒增強作用有顯著性差異(P=0.000)。利用eGFP標(biāo)記的HIV-1 NL4-3假病毒系統(tǒng)表明,在4℃溫度下(病毒并不進入細(xì)胞內(nèi)),用流式細(xì)胞儀檢測,淀粉樣多肽能促進病毒結(jié)合到細(xì)胞表面。Viruspull-down assay,cell-binding assay表明,這些淀粉樣多肽能分別捕獲病毒或結(jié)合到細(xì)胞表面,從而增強病毒的感染性。但

18、陰離子聚合物未能拮抗gp120衍生的淀粉樣多肽對病毒與細(xì)胞的結(jié)合,這說明gp120衍生的淀粉樣多肽不是依靠靜電吸附力與病毒或細(xì)胞結(jié)合的。
　　 5.來源于gp120β20的淀粉樣多肽6313能降低高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療藥物的抗病毒活性,2μM的6313能使抗病毒藥物的抗病毒活性降低3-16倍。
　　 6.EGCG能有效的抑制gp120來源的淀粉樣多肽的形成,阻斷淀粉樣纖維的形態(tài),拮抗淀粉樣多肽介導(dǎo)的增強病毒感染的活性,使抗

19、病毒藥物,在淀粉樣多肽存在降低的抗病毒活性恢復(fù)正常水平。
　　 7.體外gp120多肽的降解實驗表明,在37℃孵育下,gp120能緩慢釋放一些小分子量短肽片段(～4K),而且通過透射電鏡能觀察出淀粉樣纖維狀物質(zhì)。
　　 結(jié)論:
　　 1.低濃度病毒量適用于多肽/化合物增強病毒感染活性的檢測。
　　 2.HIV-1gp120衍生的具有增強病毒感染活性的多肽來源于gp120β-折疊區(qū)域,其促進病毒感染的機制是

20、形成富含β-片層結(jié)構(gòu)的淀粉樣纖維狀的聚合物,這些大分子聚合物能結(jié)合病毒與靶細(xì)胞,從而把兩者拉近,促進病毒的感染。gp120衍生淀粉樣多肽能廣譜促進不同亞型,不同受體嗜性病毒的感染,而且也能促進病毒在細(xì)胞-細(xì)胞間的傳播。
　　 3.這些來源于gp120β-折疊區(qū)域的多肽,有可能原因具有結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢,易于聚集形成β-片層結(jié)構(gòu)而形成淀粉樣纖維的形態(tài),進而促進病毒的感染。對于多肽二級結(jié)構(gòu)與淀粉樣形成趨勢相關(guān)性的研究與分析,對于我們科研工作

21、中隨機設(shè)計合成淀粉樣多肽用于一些基因治療藥物或技術(shù)的開發(fā)提供新思路。
　　 4.體外HIV-1gp120降解實驗初步證明,在37℃孵育條件下,gp120不穩(wěn)定,能釋放出一些小分子量的多肽,并檢測出淀粉樣纖維的存在。這些淀粉樣多肽不僅能促進病毒的感染,而且能拮抗抗病毒藥物的抗病毒活性,也即說明,這些淀粉樣物質(zhì)的存在,能降低病人對藥物的敏感性。雖然現(xiàn)在普遍認(rèn)為病人的耐藥性與病毒的基因突變相關(guān),但有文獻報道[58],在產(chǎn)生耐藥的人群中

22、,有接近20％的病例可能與病毒基因型耐藥無關(guān)。HIV-1gp120是存在于人體內(nèi)的。那么,在人體內(nèi)HIV-1 gp120是否能降解釋放出這些淀粉樣多肽,從而一方面促進病毒感染,影響疾病的進程?另一方面使病人對藥物的敏感性降低呢?本課題的研究為回答以上兩個gp120降解生理意義的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 5.EGCG是一個有效的抑制和阻斷淀粉樣物質(zhì)的小分子藥物。EGCG能有效的抑制gp120來源的多肽形成淀粉樣結(jié)構(gòu),阻斷淀粉樣纖維的形

23、態(tài),拮抗淀粉樣多肽增強病毒感染的活性,使抗病毒藥物在淀粉樣多肽存在降低的抗病毒活性得到恢復(fù)。
　　 第二部分、精液蛋白拮抗陰離子型多聚物類殺微生物劑抗HIV活性的分子機制研究
　　 目的:本研究擬采用多種生物物理、生物化學(xué)手段,深入研究陰離子多聚物類殺微生物劑與精液來源的病毒增強因子(SEVI)的相互作用及機制,從而從藥物-宿主蛋白相互作用的角度,闡明一個陰離子多聚物類殺微生物劑臨床試驗失敗的原因。研究內(nèi)容包括陰離子多聚

24、物殺微生物劑促進精液來源的病毒增強因子的淀粉樣纖維的形成,陰離子多聚物與精液相關(guān)蛋白的相互作用,以及相關(guān)的藥物抗病毒活性的評價。研究結(jié)果將提示精液蛋白對于評價殺微生物劑的重要性,也將指出哪類藥物不適合開發(fā)為殺微生物劑,對于未來殺微生物劑的研發(fā)具有重要的理論指導(dǎo)意義。
　　 方法:
　　 1.我們選取以下陰離子多聚物類殺微生物劑作為我們研究的對象,包括:硫酸纖維素(Cellulose sulfate,CS),角叉菜膠(Ca

25、rrageenan),鄰苯二甲酸纖維素(Cellulose acetate1,2-benzenedicarboxylate,CAP),聚苯乙烯磺酸鈉(Polystyrene sulfonate)。建立起一系列生物物理、生物化學(xué)手段,包括硫磺素T染色法,剛果紅染色法,圓二色譜法,透射電鏡法,探討陰離子多聚物類殺微生物劑促進精液來源的病毒增強因子,即SEVI,淀粉樣纖維形成的作用。并考察這種促進作用的量效關(guān)系。
　　 2.建立酸性凝

26、膠電泳法、Western blot及ELISA分析陰離子多聚物類殺微生物劑與精液來源多肽(即SEVI原型多肽PAP248-286)的相互作用。
　　 3.分別考察在PAP248-286或精液存在下,陰離子多聚物類殺微生物劑抗實驗株病毒ⅢB(X4型病毒)和BaL(R5型病毒)感染活性的影響。
　　 4.考察在陰離子多聚物類殺微生物劑存在下,PAP248-286或精液促進克隆病毒NL4-3(X4型病毒)和81A(R5型病毒)

27、感染活性的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過硫磺素T染色法,剛果紅染色法,圓二色譜法,透射電鏡法,本研究所包括的陰離子多聚物殺微生物劑都能普遍加速PAP248-286多肽形成淀粉樣纖維的過程,并且這種促進作用呈量效關(guān)系。陰離子多聚物殺微生物劑促進PAP248-286多肽形成淀粉樣纖維是通過促進其β-片層結(jié)構(gòu)的形成。
　　 2.通過酸性凝膠電泳法、Western blot及ELISA,我們證明了陰離子多聚物殺微生

28、物劑與多肽PAP248-286能夠相互作用,通過采用其它天然陰離子多聚物拮抗聚合的實驗,證明這種結(jié)合是通過靜電吸引力相互作用的。
　　 3.在PAP248-286或精液存在下,各陰離子多聚物殺微生物劑抗實驗株病毒ⅢB或BaL病毒的感染活性下降了8～20倍。
　　 4.在各陰離子多聚物殺微生物劑存在下,PAP248-286形成的淀粉樣纖維與精液的沉淀部分都能促進病毒的感染。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究表

29、明,陰離子多聚物殺微生物劑與精液蛋白能相互作用。這種相互作用體現(xiàn)的藥物抗病毒活性的下降可總結(jié)為以下兩個原因。其一,藥物與宿主蛋白相互作用,降低了游離藥物的濃度,使得藥物抗病毒效果下降；其二,陰離子多聚物殺微生物劑與精液來源病毒增強因子的相關(guān)多肽相互作用,加速這些多肽的聚合并形成淀粉樣纖維,從而增加了精液中增強病毒感染的因素,進一步削弱了體系中的抗病毒活性。
　　 2.本研究提示:精液作為殺微生物劑研究的重要媒介,應(yīng)給予足夠的重視