抗艾滋病毒辣中草藥的快速篩選.pdf

1、目的：艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合征)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)所引起的[1]。HIV以人體免疫系統(tǒng)的中樞細(xì)胞-T4淋巴細(xì)胞為攻擊目標(biāo)，使患者的免疫系統(tǒng)失衡，免疫功能低下，進(jìn)而使人體成為各種疾病的載體，極易感染各種并發(fā)癥或腫瘤最終死亡。艾滋病在世界范圍內(nèi)的瘋狂流行及高死亡率，嚴(yán)重威脅著人類的健康及社會(huì)的發(fā)展。目前常用的治療艾滋病的藥物主要是蛋白酶抑制劑類藥物和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類藥物。這些藥物成本高、副作用大、易引起各種并發(fā)癥，并且無法兼

2、顧對(duì)抗艾滋病毒及患者的免疫系統(tǒng)[2]。同時(shí)由于HIV-1在遭受藥物攻擊以后，其DNA在復(fù)制的過程中會(huì)發(fā)生基因突變，使得HIV-1病毒產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，從而使病人產(chǎn)生耐藥性。由于艾滋病人死亡的主要原因是患者的免疫系統(tǒng)被破壞，患者遭受各種機(jī)遇性感染而死亡，而中醫(yī)是從整體觀點(diǎn)進(jìn)行辨證施治對(duì)癥下藥，以提高機(jī)體的免疫力為目的。而且中藥副作用小，不會(huì)引起各種并發(fā)癥，同時(shí)來源廣泛，價(jià)格低廉，因而避免了西醫(yī)治療價(jià)格昂貴、毒性大、耐藥性等缺點(diǎn)，其開發(fā)前景可

3、觀。隨著治療艾滋病的新靶點(diǎn)--P-TEFb的發(fā)現(xiàn)，一旦我們得到了可以競(jìng)爭性結(jié)合CyclinT1，有效阻止CyclinT1與Tat結(jié)合的藥物，抑制P-TEFb的活性，進(jìn)而阻斷艾滋病毒基因組的復(fù)制，便可以保證該種藥物對(duì)HIV-1的攻擊長期有效，也就可以克服抗艾藥物耐藥性的問題[3]。
　　鑒于此，本論文構(gòu)建出真核生物表達(dá)載體，利用釀酒酵母這一模式生物，運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，依賴治療艾滋病的新靶點(diǎn)--P-TEFb，快速篩出可阻止Cycli

4、nT1與Tat互作，從而抑制p-TEFb的活性的中草藥，為其進(jìn)入臨床治療使用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　方法：通過將目的基因CyclinT1和Tat分別連接入載體質(zhì)粒pGBKT7和pGADT7-ReC上，構(gòu)建出真核表達(dá)載體pGBKT7-CyclinT1和pGADT7-ReC-Tat；將真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，對(duì)中草藥進(jìn)行篩選；依據(jù)抗艾新靶點(diǎn)P-TEFb的特性，篩選出能夠抑制Cyclint1和Tat互作，從而抑

5、制P-TEFb的活性，阻斷艾滋病毒基因組復(fù)制的有效中草藥，達(dá)到快速篩選抗艾藥物的目的。
　　結(jié)果：1、本研究通過PCR擴(kuò)增出正確的目的基因片段Cyclint1和Tat，運(yùn)用分子生物學(xué)方法成功構(gòu)建出真核生物表達(dá)載體pGBKT7-CyclinT1和pGADT7-ReC-Tat；
　　2、成功將真核生物表達(dá)載體pGBKT7-CyclinT1和pGADT7-ReC-Tat轉(zhuǎn)入釀酒酵母AH109菌株中，經(jīng)驗(yàn)證，二者確實(shí)相互作用，成功構(gòu)