中國(guó)甜柿自然脫澀相關(guān)基因ALDH2的功能分析.pdf

1、中國(guó)甜柿自然脫澀性狀受顯性單基因控制，因而在完全甜柿遺傳改良中具有重大的應(yīng)用價(jià)值，但其自然脫澀關(guān)鍵基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不完全明確。已知中國(guó)甜柿自然脫澀過(guò)程與乙醛介導(dǎo)的“凝固效應(yīng)”（即可溶性單寧向不溶性單寧的轉(zhuǎn)化過(guò)程）有關(guān)，但乙醛代謝下游的關(guān)鍵基因ALDH2（醛脫氫酶2基因家族）在其中的功能特性尚不清楚。本研究以中國(guó)甜柿（‘鄂柿1號(hào)’和‘羅田甜柿’），日本甜柿（‘陽(yáng)豐’）和非完全甜柿（‘磨盤(pán)柿’）為試材，首先基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中ALDH2基因

2、相關(guān)差異表達(dá)片段，從‘鄂柿1號(hào)’（Diospyros kaki Thunb.‘Eshi1’）中分離獲得了ALDH2基因家族成員的cDNA全長(zhǎng)，分析其表達(dá)模式并利用柿葉片瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)體系對(duì)ALDH2基因進(jìn)行功能驗(yàn)證;進(jìn)而，應(yīng)用酵母單雜交系統(tǒng)篩選與ALDH2基因互作的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步明確中國(guó)甜柿自然脫澀的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò);最后，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和柿瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，分析ALDH2及部分單寧代謝關(guān)鍵基因在中國(guó)甜柿葉片中瞬時(shí)超表達(dá)后的差異表達(dá)基因，進(jìn)

3、一步挖掘與中國(guó)甜柿自然脫澀直接相關(guān)的候選基因，以期為中國(guó)甜柿自然脫澀分子機(jī)理的解析及其遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息，通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)技術(shù)獲得ALDH2基因家族兩個(gè)成員——DkALDH2a和DkALDH2b，其cDNA序列全長(zhǎng)分別為1，984bp和1，933bp，分別編碼542和540個(gè)

4、氨基酸。DkALDH2a和DkALDH2b在中國(guó)甜柿葉片中瞬時(shí)超表達(dá)后，葉片可溶性單寧和不溶性單寧含量均顯著升高;瞬時(shí)干涉表達(dá)后，葉片中可溶性單寧含量前者無(wú)明顯變化，后者顯著降低。二者均可通過(guò)減少可溶性單寧的消耗進(jìn)而抑制脫澀。
　　2.DkALDH2a主要作用于種子器官，其表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中逐漸降低，以致大量乙醛從種子擴(kuò)散到果肉中，進(jìn)而通過(guò)凝固效應(yīng)促進(jìn)脫澀。DkALDH2b主要是直接在果肉中大量表達(dá)，這可能是由于果肉中底物乙醛

5、的積累所致，但其消耗的乙醛不足以阻止中國(guó)甜柿自然脫澀。因此，DkALDH2a和DkALDH2b的表達(dá)量與中國(guó)甜柿自然脫澀呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　3.基于DkALDH2a和DkALDH2b全長(zhǎng)序列信息，通過(guò)染色體步移技術(shù)分別分離到515bp和1，209bp啟動(dòng)子序列。以DkALDH2b啟動(dòng)子構(gòu)建pALDH2b-AbAi誘餌載體并轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母菌株，應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)從酵母文庫(kù)中篩選到16個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)序列分析后新發(fā)現(xiàn)1個(gè)與ALD

6、H2b互作的BBR/BPC1轉(zhuǎn)錄因子。
　　4.結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和柿瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，篩選ALDH2及單寧代謝關(guān)鍵基因LAC1和ANR在中國(guó)甜柿葉片中瞬時(shí)超表達(dá)后的特異表達(dá)基因，共得到119.63GbClean Data。通過(guò)Trinity軟件從頭拼接(de novo assembly)，共得到192，597個(gè)轉(zhuǎn)錄本、100，371條Unigene。其中56，009條Unigene（約55.8％）獲得了功能注釋信息。注釋為ERF家族