與中國(guó)原產(chǎn)完全甜柿乙醇脫澀相關(guān)基因的篩選.pdf

1、中國(guó)原產(chǎn)完全甜柿(簡(jiǎn)稱中國(guó)甜柿或C-PCNA)是在湖北省大別山區(qū)發(fā)現(xiàn)的完全甜柿種質(zhì)資源，具有解決甜柿親本稀少而造成的近交退化現(xiàn)象的應(yīng)用潛力，但其遺傳背景及脫澀機(jī)理尚不清楚。本研究以‘小果甜柿’(Diospyros kaki Thunb?！甔iaoguo-tianshi’)為試材，采用SSH(抑制消減雜交)技術(shù)篩選人工脫澀過程中差異表達(dá)基因，以期為探討其脫澀機(jī)理及其遺傳改良提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.本試驗(yàn)

2、構(gòu)建10%乙醇處理果實(shí)的正反向消減文庫(kù)；正向文庫(kù)隨機(jī)挑選和保存1600個(gè)陽性克隆，反向文庫(kù)隨機(jī)挑選和保存1800個(gè)陽性克隆。
　　 2.本試驗(yàn)利用抗生素和菌液PCR等方法篩選文庫(kù)陽性克??；菌液PCR分析表明，克隆插入片段在300-1200 bp之間，文庫(kù)重組率為95%；正向文庫(kù)隨機(jī)挑選34個(gè)陽性克隆測(cè)序獲得32條有效EST序列，反向文庫(kù)挑選59個(gè)陽性克隆測(cè)序獲得55條有效EST序列；剔除重復(fù)序列和小于100 bp序列，兩庫(kù)序列合

3、并組裝獲得70條序列。利用BLAST進(jìn)行非冗余(non-redundant)數(shù)據(jù)庫(kù)序列相似性比對(duì)，其中53條序列有確切功能，根據(jù)其預(yù)測(cè)功能進(jìn)行GO(gene ontology)分類，其生物學(xué)功能有：轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)2個(gè)、催化活性(catalytic activity)22個(gè)、結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)3個(gè)、分子傳感器活性(molecular transdu

4、ceractivity)1個(gè)和綁定活性(binding activity)24個(gè)。
　　 3.正向文庫(kù)獲得8條與脫澀相關(guān)的EST序列，其中包括參與柿果實(shí)無氧條件下乙醇發(fā)酵代謝過程的兩個(gè)關(guān)鍵酶-丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)和乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)基因序列；另外六個(gè)編碼的蛋白分別為NADH泛醌氧化還原酶亞基7(nadh-plastoquinone ox

5、idoreductase subunit7，NQO)、甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase，F(xiàn)DH)、跨膜超家族9成員4(transmembrane9superfamily member4-like，TM9SF-4)、液泡巰基蛋白酶(thiol protease aleurain)、細(xì)胞色素B還原酶(cytochrome b reductase)和MYB轉(zhuǎn)錄因子(myb familytranscription fact

6、or)。
　　 4.反向文庫(kù)獲得14條與脫澀相關(guān)的EST序列，編碼的蛋白包括：S-腺苷甲硫氨酸合成酶(s-adenosylmethionine synthetase，SAMS)；cop9信號(hào)小體復(fù)合體亞基5A(cop9 signalosome complex subunit5a-like)；ring-box蛋白(ring-box protein，RBX)；cullin3蛋白(cullin3)；組蛋白h3(histone h3)；

7、雙因子響應(yīng)調(diào)節(jié)閥arr11(two-component response regulator arr11)；組織蛋白酶b(cathepsin b)；過敏誘導(dǎo)響應(yīng)蛋白(hypersensitive-induced response protein)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)；小分子熱休克蛋白(small heatshock protein)；核酮

8、糖二磷酸羧化酶小鏈(ribulose bisphosphate carboxylase smallchain)；cc-nbs-lrr抗性蛋白(cc-nbs-lrr resistance protein)；蛋白-L-異天冬氨酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶(protein-L-isoaspartate o-methyltransferase)和kdaⅠ類熱休克蛋白(kda classi heat shock protein)。
　　 綜上所述，中