臭氧對兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎作用的實驗研究.pdf

1、退行性骨關(guān)節(jié)炎(degenerative osteoarthritis OA)病因尚未完全明了，目前認為是多因素致病，臨床上采用醫(yī)用臭氧(O3)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療早～中期OA取得了較好的療效，但O3的作用效應(yīng)及其治療機理目前仍不甚明了，本實驗采用Hulth模型造模后，在兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射臭氧(O3)，探討O3抑制軟骨細胞退變作用效應(yīng)及機理，為醫(yī)用O3治療早～中期OA提供實驗支持。
　　 一、O3對關(guān)節(jié)軟骨的病理改變的影響
　　

2、 目的：觀察O3對Hulth模型OA軟骨光鏡下改變的影響。
　　 方法：32只兔隨機分為2組，分別為治療組16只，模型組16只，采用Hulth模型，白手術(shù)當(dāng)日起肌注普魯卡因青霉素40萬u，每日一次，連續(xù)3天；治療組每日向治療組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO3-O3混合氣體2ml，連續(xù)注射7天；對照組每日向?qū)φ战M兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO22ml，連續(xù)注射7天；連續(xù)注射7天后，耳緣靜脈注入空氣處死實驗兔，將實驗兔的左膝關(guān)

3、節(jié)備皮，碘伏消毒，切開左膝關(guān)節(jié)腔，行大體觀察，銳利刀片切取左股骨內(nèi)髁軟骨，將軟骨標本置于10％甲醛中固定，經(jīng)一系列脫水、10％EDTA脫鈣處理，共10天；軟骨組織石蠟包埋；腿染色，生物顯微鏡觀察。
　　 結(jié)果：O3實驗組軟骨表面細胞變性、排列紊亂、可見軟骨細胞壞死、脫落，少量的炎性滲出物，軟骨表面可見糜爛斑，成纖維細胞和毛細血管增生相對少見；OA對照組軟骨表面細胞排列紊亂、壞死、變性較實驗組明顯，可見明顯的潰瘍，達深層軟骨，可見

4、明顯的炎性細胞滲出及成纖維細胞和新生的毛細血管增生，可見纖維組織增生于潰瘍底部及潰瘍底部的軟骨細胞變性。
　　 結(jié)論：O3試驗組關(guān)節(jié)軟骨退變的程度較OA對照組減輕，軟骨缺損也較輕，表明40mg/L O2-O3的混合氣體能有效延緩?fù)孟リP(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的軟骨退變的病理進程。
　　 二、O3對軟骨細胞中IL-1β表達的影響
　　 目的：觀察O3對Hulth模型OA軟骨細胞中IL-1β表達的影響。
　　 方法：將36

5、只兔隨機分為3組，分別為治療組16只，模型組16只，正常組4只，采用Hulth模型，自手術(shù)當(dāng)日起肌注普魯卡因青霉素40萬u，每日一次，連續(xù)3天；治療組每日向治療組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO2-O3混合氣體2ml，連續(xù)注射7天；對照組每日向?qū)φ战M兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO22ml，連續(xù)注射7天；連續(xù)注射7天后，耳緣靜脈注入空氣處死實驗兔，將實驗兔的左膝關(guān)節(jié)備皮，碘伏消毒，切開左膝關(guān)節(jié)腔，耳緣靜脈注入空氣栓塞處死實驗兔，造模的左

6、膝關(guān)節(jié)備皮，消毒，切開膝關(guān)節(jié)，刀片切取左側(cè)股骨內(nèi)髁軟骨修剪成1×1×2mm小條，3％戊二醛酸溶液固定24小時；DAB法檢測軟骨細胞IL-1β；每張切片在軟骨破壞的邊緣隨機選取視野，每個視野計數(shù)200個細胞，統(tǒng)計陽性染色細胞的個數(shù)，以陽性細胞率作為IL-1β的表達指標。
　　 結(jié)果：正常組(A組)陽性細胞率為2.815±0.827％，模型組(B組)陽性細胞率為47.159±4.431％①，03治療組(C組)陽性細胞率為27.771

7、±4.085％②；模型組(B組)與正常對照組(A組)比較，p<0.01；治療組(C組)與模型組(B組)比較，p<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：實驗組軟骨細胞中IL-1β含量低于對照組，提示O3能夠降低軟骨細胞中IL-1β含量，保護關(guān)節(jié)軟骨。
　　 三、O3對關(guān)節(jié)液中一氧化氮含量的影響
　　 目的：觀察O3對Hulth模型OA關(guān)節(jié)液中一氧化氮(nrticioxide，NO)的含量的影響。
　　 方法

8、：32只兔隨機分為2組，分別為治療組16只，模型組16只，采用Hulth模型，自手術(shù)當(dāng)日起肌注普魯卡因青霉素40萬u，每日一次，連續(xù)3天；治療組每日向治療組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO2-O3混合氣體2ml，連續(xù)注射7天；對照組每日向?qū)φ战M兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO22ml，連續(xù)注射7天；連續(xù)注射7天后，將實驗兔以速眠新Ⅱ號注射液(0.2ml/kg)肌肉內(nèi)注射麻醉，麻醉效果滿意后，將造模的左膝關(guān)節(jié)備皮，碘伏消毒，膝關(guān)節(jié)穿刺，刺

9、入關(guān)節(jié)腔后，用1 ml生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，反復(fù)注入、回抽3次后，抽盡液體，注入試管，-70℃封存?zhèn)錅y；硝酸還原酶法測定關(guān)節(jié)液中NO的含量。
　　 結(jié)果：對照組NO的含量為145.57±12.17，實驗組為132.33±11.14，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組與對照組比較p<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義.
　　 結(jié)論：實驗組關(guān)節(jié)液中NO含量低于對照組，提示O3能夠降低關(guān)節(jié)液中NO含量，保護關(guān)節(jié)軟骨。
　　 四、O3對軟骨細胞iN

10、OS表達的影響
　　 目的：觀察O3對Hulth模型OA軟骨細胞中iNOS表達的影響。
　　 方法：32只兔隨機分為2組，分別為治療組16只，模型組16只，采用Hulth模型，自手術(shù)當(dāng)日起肌注普魯卡因青霉素40萬u，每日一次，連續(xù)3天；治療組每日向治療組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO2-O3混合氣體2ml，連續(xù)注射7天；對照組每日向?qū)φ战M兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO22ml，連續(xù)注射7天；連續(xù)注射7天后，耳緣靜脈注

11、入空氣，栓塞處死實驗兔，造模的左膝關(guān)節(jié)備皮，消毒，立即切開左側(cè)膝關(guān)節(jié)，刀片切取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨修剪成1×1×2mm小條，半定量RT-PCR的方法檢測軟骨中一氧化氮合酶的含量。
　　 結(jié)果：實驗組iNOS mRNA的含量為0.74±0.17，對照組iNOS mRNA的含量為0.83±0.21，統(tǒng)計學(xué)分析顯示：兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.191，P<0.01)，進一步的統(tǒng)計學(xué)分析顯示，O3實驗組軟骨iNOS mRNA的表達水平

12、顯著低于對照組。
　　 結(jié)論：對照組OA軟骨中iNOS高表達，實驗組OA軟骨中iNOS低表達，實驗組軟骨iNOS mRNA的表達水平顯著低于對照組，O3可以明顯地抑制軟骨iNOS的表達。
　　 五、O3對軟骨細胞MMP-1表達的影響
　　 目的：觀察O3對Hulth模型OA軟骨細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)表達的影響。
　　 方法：32只兔隨機分為2組，分別為治療組16只，模型組16只，采用Hul

13、th模型，自手術(shù)當(dāng)日起肌注普魯卡因青霉素40萬u，每日一次，連續(xù)3天；治療組每日向治療組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO2-O3混合氣體2ml，連續(xù)注射7天；對照組每日向?qū)φ战M兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO22ml，連續(xù)注射7天；連續(xù)注射7天后，耳緣靜脈注入空氣，栓塞處死實驗兔，造模的左膝關(guān)節(jié)備皮，消毒，立即切開左側(cè)膝關(guān)節(jié)，刀片切取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨修剪成1×1×2mm小條，半定量RT-PCR的方法檢測軟骨中MMP-1的含量。