臭氧對(duì)兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、退行性骨關(guān)節(jié)炎(degenerative osteoarthritis OA)病因尚未完全明了，目前認(rèn)為是多因素致病，臨床上采用醫(yī)用臭氧(O3)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療早～中期OA取得了較好的療效，但O3的作用效應(yīng)及其治療機(jī)理目前仍不甚明了，本實(shí)驗(yàn)采用Hulth模型造模后，在兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射臭氧(O3)，探討O3抑制軟骨細(xì)胞退變作用效應(yīng)及機(jī)理，為醫(yī)用O3治療早～中期OA提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　 一、O3對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的病理改變的影響
　　

2、 目的：觀察O3對(duì)Hulth模型OA軟骨光鏡下改變的影響。
　　 方法：32只兔隨機(jī)分為2組，分別為治療組16只，模型組16只，采用Hulth模型，白手術(shù)當(dāng)日起肌注普魯卡因青霉素40萬u，每日一次，連續(xù)3天；治療組每日向治療組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO3-O3混合氣體2ml，連續(xù)注射7天；對(duì)照組每日向?qū)φ战M兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO22ml，連續(xù)注射7天；連續(xù)注射7天后，耳緣靜脈注入空氣處死實(shí)驗(yàn)兔，將實(shí)驗(yàn)兔的左膝關(guān)

3、節(jié)備皮，碘伏消毒，切開左膝關(guān)節(jié)腔，行大體觀察，銳利刀片切取左股骨內(nèi)髁軟骨，將軟骨標(biāo)本置于10％甲醛中固定，經(jīng)一系列脫水、10％EDTA脫鈣處理，共10天；軟骨組織石蠟包埋；腿染色，生物顯微鏡觀察。
　　 結(jié)果：O3實(shí)驗(yàn)組軟骨表面細(xì)胞變性、排列紊亂、可見軟骨細(xì)胞壞死、脫落，少量的炎性滲出物，軟骨表面可見糜爛斑，成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生相對(duì)少見；OA對(duì)照組軟骨表面細(xì)胞排列紊亂、壞死、變性較實(shí)驗(yàn)組明顯，可見明顯的潰瘍，達(dá)深層軟骨，可見

4、明顯的炎性細(xì)胞滲出及成纖維細(xì)胞和新生的毛細(xì)血管增生，可見纖維組織增生于潰瘍底部及潰瘍底部的軟骨細(xì)胞變性。
　　 結(jié)論：O3試驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨退變的程度較OA對(duì)照組減輕，軟骨缺損也較輕，表明40mg/L O2-O3的混合氣體能有效延緩?fù)孟リP(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的軟骨退變的病理進(jìn)程。
　　 二、O3對(duì)軟骨細(xì)胞中IL-1β表達(dá)的影響
　　 目的：觀察O3對(duì)Hulth模型OA軟骨細(xì)胞中IL-1β表達(dá)的影響。
　　 方法：將36

5、只兔隨機(jī)分為3組，分別為治療組16只，模型組16只，正常組4只，采用Hulth模型，自手術(shù)當(dāng)日起肌注普魯卡因青霉素40萬u，每日一次，連續(xù)3天；治療組每日向治療組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO2-O3混合氣體2ml，連續(xù)注射7天；對(duì)照組每日向?qū)φ战M兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO22ml，連續(xù)注射7天；連續(xù)注射7天后，耳緣靜脈注入空氣處死實(shí)驗(yàn)兔，將實(shí)驗(yàn)兔的左膝關(guān)節(jié)備皮，碘伏消毒，切開左膝關(guān)節(jié)腔，耳緣靜脈注入空氣栓塞處死實(shí)驗(yàn)兔，造模的左

6、膝關(guān)節(jié)備皮，消毒，切開膝關(guān)節(jié)，刀片切取左側(cè)股骨內(nèi)髁軟骨修剪成1×1×2mm小條，3％戊二醛酸溶液固定24小時(shí)；DAB法檢測(cè)軟骨細(xì)胞IL-1β；每張切片在軟骨破壞的邊緣隨機(jī)選取視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽性染色細(xì)胞的個(gè)數(shù)，以陽性細(xì)胞率作為IL-1β的表達(dá)指標(biāo)。
　　 結(jié)果：正常組(A組)陽性細(xì)胞率為2.815±0.827％，模型組(B組)陽性細(xì)胞率為47.159±4.431％①，03治療組(C組)陽性細(xì)胞率為27.771

7、±4.085％②；模型組(B組)與正常對(duì)照組(A組)比較，p<0.01；治療組(C組)與模型組(B組)比較，p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞中IL-1β含量低于對(duì)照組，提示O3能夠降低軟骨細(xì)胞中IL-1β含量，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。
　　 三、O3對(duì)關(guān)節(jié)液中一氧化氮含量的影響
　　 目的：觀察O3對(duì)Hulth模型OA關(guān)節(jié)液中一氧化氮(nrticioxide，NO)的含量的影響。
　　 方法

8、：32只兔隨機(jī)分為2組，分別為治療組16只，模型組16只，采用Hulth模型，自手術(shù)當(dāng)日起肌注普魯卡因青霉素40萬u，每日一次，連續(xù)3天；治療組每日向治療組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO2-O3混合氣體2ml，連續(xù)注射7天；對(duì)照組每日向?qū)φ战M兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO22ml，連續(xù)注射7天；連續(xù)注射7天后，將實(shí)驗(yàn)兔以速眠新Ⅱ號(hào)注射液(0.2ml/kg)肌肉內(nèi)注射麻醉，麻醉效果滿意后，將造模的左膝關(guān)節(jié)備皮，碘伏消毒，膝關(guān)節(jié)穿刺，刺

9、入關(guān)節(jié)腔后，用1 ml生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，反復(fù)注入、回抽3次后，抽盡液體，注入試管，-70℃封存?zhèn)錅y(cè)；硝酸還原酶法測(cè)定關(guān)節(jié)液中NO的含量。
　　 結(jié)果：對(duì)照組NO的含量為145.57±12.17，實(shí)驗(yàn)組為132.33±11.14，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)液中NO含量低于對(duì)照組，提示O3能夠降低關(guān)節(jié)液中NO含量，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。
　　 四、O3對(duì)軟骨細(xì)胞iN

10、OS表達(dá)的影響
　　 目的：觀察O3對(duì)Hulth模型OA軟骨細(xì)胞中iNOS表達(dá)的影響。
　　 方法：32只兔隨機(jī)分為2組，分別為治療組16只，模型組16只，采用Hulth模型，自手術(shù)當(dāng)日起肌注普魯卡因青霉素40萬u，每日一次，連續(xù)3天；治療組每日向治療組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO2-O3混合氣體2ml，連續(xù)注射7天；對(duì)照組每日向?qū)φ战M兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO22ml，連續(xù)注射7天；連續(xù)注射7天后，耳緣靜脈注

11、入空氣，栓塞處死實(shí)驗(yàn)兔，造模的左膝關(guān)節(jié)備皮，消毒，立即切開左側(cè)膝關(guān)節(jié)，刀片切取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨修剪成1×1×2mm小條，半定量RT-PCR的方法檢測(cè)軟骨中一氧化氮合酶的含量。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組iNOS mRNA的含量為0.74±0.17，對(duì)照組iNOS mRNA的含量為0.83±0.21，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.191，P<0.01)，進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，O3實(shí)驗(yàn)組軟骨iNOS mRNA的表達(dá)水平

12、顯著低于對(duì)照組。
　　 結(jié)論：對(duì)照組OA軟骨中iNOS高表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組OA軟骨中iNOS低表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組軟骨iNOS mRNA的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，O3可以明顯地抑制軟骨iNOS的表達(dá)。
　　 五、O3對(duì)軟骨細(xì)胞MMP-1表達(dá)的影響
　　 目的：觀察O3對(duì)Hulth模型OA軟骨細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)表達(dá)的影響。
　　 方法：32只兔隨機(jī)分為2組，分別為治療組16只，模型組16只，采用Hul

13、th模型，自手術(shù)當(dāng)日起肌注普魯卡因青霉素40萬u，每日一次，連續(xù)3天；治療組每日向治療組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO2-O3混合氣體2ml，連續(xù)注射7天；對(duì)照組每日向?qū)φ战M兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40mg/LO22ml，連續(xù)注射7天；連續(xù)注射7天后，耳緣靜脈注入空氣，栓塞處死實(shí)驗(yàn)兔，造模的左膝關(guān)節(jié)備皮，消毒，立即切開左側(cè)膝關(guān)節(jié)，刀片切取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨修剪成1×1×2mm小條，半定量RT-PCR的方法檢測(cè)軟骨中MMP-1的含量。