神經(jīng)發(fā)生在大鼠垂體切除后中樞性尿崩癥的研究.pdf

1、研究背景:
　　哺乳動(dòng)物的下丘腦神經(jīng)垂體束(Hypothalamo-neurohypophyseal Tract)由下丘腦室旁核（Paraventricular hypothalamic Nucleus，PVN）和視上核(SupraopticNucleus，SON)大細(xì)胞神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)軸突形成，軸突延伸至垂體后葉，主要有合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放大細(xì)胞神經(jīng)元分泌的精氨酸加壓素(Arginine Vasporessin，AVP)和催產(chǎn)素(O

2、xytocin，OT)的功能。而缺乏精氨酸加壓素則會(huì)出現(xiàn)尿量增多、尿比重減少、多飲等癥狀。下丘腦神經(jīng)垂體系統(tǒng)的垂體束損傷方式一般可以通過(guò)切除垂體來(lái)達(dá)到造模目的，常用的手術(shù)入路有咽旁入路和經(jīng)耳入路，而咽旁人路因?yàn)閷?duì)動(dòng)物損傷大，術(shù)后并發(fā)癥多，術(shù)后長(zhǎng)期存活率較低的缺點(diǎn)，不適合長(zhǎng)期觀察實(shí)驗(yàn)，所以擬使用經(jīng)耳入路，而立體定向下經(jīng)耳入路為方便快捷的造模方法，術(shù)后恢復(fù)快，存活率較高，但是也具有不能全切除垂體和造模率低的缺點(diǎn)，而同時(shí)也有對(duì)動(dòng)物大小有限制，

3、為了穩(wěn)定造模成功率，迫切需要探求適合手術(shù)的動(dòng)物。垂體切除術(shù)后的一系列復(fù)雜的病理生理改變?nèi)匀恍枰粩嗟奶剿?，不少學(xué)者認(rèn)為是由于下丘腦神經(jīng)垂體的系統(tǒng)(Hypothalamo-neurohypophyseal System，HNS)損傷后，導(dǎo)致下丘腦的大細(xì)胞神經(jīng)元的逆行性退變，最終因?yàn)榉置诩に販p少產(chǎn)生中樞性尿崩癥。同時(shí)也有不少研究提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷的可能伴隨新生細(xì)胞，而部分新生細(xì)胞通過(guò)一段時(shí)間的生長(zhǎng)后會(huì)分化并成熟為神經(jīng)元，并具有神經(jīng)元表達(dá)

4、的蛋白和功能。然而并未確切報(bào)道證實(shí)垂體切除模型中下丘腦室旁核或視上核是否有神經(jīng)發(fā)生，而新生細(xì)胞是否并具有釋放激素功能以及新生神經(jīng)元與中樞性尿崩癥的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步闡述。神經(jīng)發(fā)生為神經(jīng)前體細(xì)胞產(chǎn)生具有功能的神經(jīng)元的一個(gè)過(guò)程，近幾十年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明成年哺乳動(dòng)物腦中存在神經(jīng)干細(xì)胞，能增值和分化為新的神經(jīng)元，具有功能性并整合到成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，成年動(dòng)物腦內(nèi)存在神經(jīng)干細(xì)胞的意義尚不太清楚，可能與其通過(guò)不斷的自我更新、遷移和分化來(lái)補(bǔ)充因疾病、

5、損傷或凋亡而丟失的神經(jīng)細(xì)胞，以維持腦功能的可塑性有關(guān)。現(xiàn)在普遍認(rèn)為至少在兩個(gè)腦區(qū)存在神經(jīng)發(fā)生，即側(cè)腦室的室管膜下區(qū)(Subventricular Zone，SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(Subgranular Zone，SGZ)。另外在黑質(zhì)、杏仁核、皮層、紋狀體等區(qū)域均有散在的神經(jīng)發(fā)生。而最近的研究發(fā)現(xiàn)在下丘腦也可能存在神經(jīng)發(fā)生。我們推想在去垂體大鼠模型中，神經(jīng)元的逆行性退變是否會(huì)同時(shí)引起同類神經(jīng)元的重新補(bǔ)充，其新生神經(jīng)元的起源位置是

6、否在下丘腦附近，是否與中樞性尿崩癥都有待研究證實(shí)。探索闡明垂體切除術(shù)后是否有神經(jīng)發(fā)生，對(duì)神經(jīng)修復(fù)的研究有重要意義，也對(duì)以后的臨床治療提供新的思路?；谝陨峡紤]，我們通過(guò)使用立體定向儀行大鼠垂體切除術(shù)，并描述對(duì)術(shù)后大鼠的中樞性尿崩的規(guī)律，找到適合觀察的時(shí)間點(diǎn)，同時(shí)利用新生細(xì)胞標(biāo)記方法，追蹤觀察術(shù)后大鼠下丘腦內(nèi)視上核與室旁核是否存在新生細(xì)胞，以及對(duì)新生細(xì)胞進(jìn)行定性，探討神經(jīng)發(fā)生在垂體切除模型中的規(guī)律。
　　研究目的:
　　1.使

7、用立體定向儀去除不同體重范圍的大鼠垂體，以建立穩(wěn)定的立體定向去垂體大鼠模型，并觀察術(shù)后中樞性尿崩的變化特征，尋找適宜觀察神經(jīng)發(fā)生的時(shí)間窗;
　　2.在不同時(shí)間段觀察大鼠去垂體術(shù)后下丘腦視上核、室旁核區(qū)域是否出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生，并觀察其成熟及存活情況;
　　研究方法:
　　第一部分立體定向下大鼠垂體切除術(shù)模型及中樞性尿崩的觀察
　　1.造模方法:利用立體定向儀經(jīng)耳入路行大鼠垂體切除。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)一:雄性

8、SD大鼠共60只，體重150-200g15只，200-250g15只，250-300g15只，300-450g15只。實(shí)驗(yàn)二:選用150-250g大鼠，垂體切除組12只，假手術(shù)組10只;
　　3.記錄術(shù)后3天內(nèi)出現(xiàn)尿崩的大鼠數(shù)量，以術(shù)后尿量大于空手術(shù)組的2倍，尿色清亮為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)比較各組術(shù)后尿崩的發(fā)生率;
　　4.記錄各組術(shù)后短期存活天數(shù)（5天）以及長(zhǎng)期存活天數(shù)（30天）大鼠數(shù)量，統(tǒng)計(jì)比較各組術(shù)后短期長(zhǎng)期存活率;
　　

9、5.術(shù)后解剖觀察垂體窩是否有殘存，統(tǒng)計(jì)各組立體定向下的全切率;
　　6.術(shù)后測(cè)定大鼠的中樞性尿崩癥的生物學(xué)特性的變化:每日測(cè)尿量、尿比重、攝水量，并繪制尿崩曲線;
　　7.數(shù)據(jù)處理:用SPSS20.0作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用卡方檢驗(yàn)、方差分析、重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析以及各時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)效應(yīng)的比較(LSD方法)，以P＜0.05表示有顯著性差異。
　　第二部分大鼠去垂體術(shù)后不同時(shí)期下丘腦新生AVP神經(jīng)元的情況<

10、br>　　1.造模及分組:造模跟第一部分一致，分組:雄性SD大鼠18只，隨機(jī)分為空手術(shù)組6只，術(shù)后10天組6只，術(shù)后20天組6只。
　　2.BrdU標(biāo)記:術(shù)后每只大鼠每天每次腹腔注射100mg/kg的BrdU，連續(xù)7天;
　　3.灌注取腦及免疫熒光檢測(cè):假手術(shù)組和垂體切除術(shù)后10天組于第10天灌注處死、20天組于術(shù)后第20天灌注處死，用生理鹽水和冰凍4％多聚甲醛心尖灌注取腦后，進(jìn)行蔗糖梯度脫水，腦組織沉底后，用冰凍切片包埋劑

11、包埋，連續(xù)切冠狀位片，做成漂片放置4度冰箱保存。視上核與室旁核BrdU染色:漂洗腦片后經(jīng)鹽酸酸化和四硼酸鈉中和，用5％BSA室溫封閉2h，用小鼠抗BrdU抗體1∶800孵育，4度過(guò)夜，漂洗后用熒光二抗488避光孵育，隔日避光PBS-T漂洗，避光孵育DAPI，滴防熒光淬滅劑熒光顯微鏡下觀察。BrdU/AVP免疫共染色:漂洗后用5％BSA封閉，用兔抗AVP抗體1∶2000孵育，4度過(guò)夜，漂洗后用熒光二抗546避光孵育，避光孵育DAPI后用甲

12、醇固定，漂洗后經(jīng)鹽酸酸化和四硼酸鈉中和后，用小鼠抗BrdU抗體1∶800孵育，4度過(guò)夜，漂洗后用熒光二抗488避光孵育，滴防熒光淬滅劑熒光顯微鏡下觀察.
　　4.熒光顯微鏡下各組取6張間隔腦片拍照，并計(jì)數(shù)各組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、AVP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、BrdU與AVP共同陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。
　　5.數(shù)據(jù)處理:用SPSS20.0作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用卡方檢驗(yàn)、方差分析，以P＜0.05表示有顯著性差異。
　　研

13、究結(jié)果:
　　1.立體定向下經(jīng)耳行大鼠垂體切除術(shù)，術(shù)后各組短期（5天）存活率和長(zhǎng)期(30天)存活率各組之間無(wú)明顯差異。各組尿崩發(fā)生率、全切除率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.立體定向大鼠垂體切除術(shù)后出現(xiàn)中樞性尿崩，經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)?zāi)虮罃?shù)據(jù)可劃分為小于47.5ml/24h與高于47.5ml/24h兩個(gè)范圍，將波動(dòng)趨勢(shì)曲線被劃分為3部分，分別為術(shù)后第1天至第6天、第7天至第11天、第12天至20天。呈三相型尿崩。術(shù)后第1天到第6天為急性期，尿

14、量、攝水量急劇升高、尿比重下降，此期尿量均值為56.4±18.9ml/24h，攝水量為63.9±27.5ml/24h，緊接著會(huì)出現(xiàn)1天或數(shù)天尿量、攝水量下降、尿比重上升的間歇期尿量、攝水量分別為40.8±12.3ml/24h，57.2±31.2ml/24h，之后尿量、攝水量重新上升，然后緩慢下降維持到一定水平的持續(xù)期，尿量、攝水量均值分別為61.1±16.5ml，63.6±30.2ml/24h，而尿比重反復(fù)波動(dòng)，急性期降至1.018±0

15、.109、間歇期1.026±0.008與空手術(shù)組無(wú)明顯差異、持續(xù)期為1.019±0.11。
　　3.術(shù)后10天、20天觀察到大鼠下丘腦視上核與室旁核內(nèi)出現(xiàn)新生細(xì)胞，以視上核區(qū)域出現(xiàn)較多。10天組視上核的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為552.7±247.9個(gè)對(duì)比20天（449.5±217.3個(gè)）無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差，10天組的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為117.6±66.2個(gè)對(duì)比20天組63.7±45.3個(gè)也無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.10天組中視上

16、核表達(dá)AVP的BrdU為113±61.1個(gè)與20天組（130±65.8個(gè)）比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在室旁核上，術(shù)后10天組的免疫共染雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)為34.8±27.6個(gè)對(duì)比20天組22.8±16.3個(gè)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而10天組的視上核與室旁核相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示術(shù)后一段時(shí)間后視上核與室旁核的新生細(xì)胞有部分可分化成熟為為表達(dá)AVP的神經(jīng)元，以視上核區(qū)域較多，而術(shù)后20天視上核的新生AVP神經(jīng)元占總AVP神經(jīng)元比例較視上核術(shù)后10天組較大。<

17、br>　　5.10天組的6只大鼠視上核陽(yáng)性細(xì)胞合計(jì)總數(shù)為11694個(gè)，6只大鼠BrdU與AVP共染雙陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)為678個(gè)，陽(yáng)性率為5.8％;20天組6只大鼠視上核陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)為6324個(gè)，6只大鼠BrdU與AVP共染雙陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)為781個(gè)，陽(yáng)性率為12.3％。x2=246.38，P＜0.01，提示20天組的視上核新生的AVP細(xì)胞占分泌AVP細(xì)胞的比例比10天組要高。而在室旁核10天組與20天組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　研究結(jié)論: