成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后的皮質(zhì)與海馬內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后皮質(zhì)的內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生
　　目的:
　　探討成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)后大腦皮質(zhì)內(nèi)源性的神經(jīng)發(fā)生及其影響因素。
　　方法:
　　Ⅰ、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1.SD大鼠分為假手術(shù)(SHAM)組和TBI組,SHAM組大鼠只開(kāi)顱,不制備腦損傷模型;TBI組大鼠采用顱腦液壓損傷裝置,制備創(chuàng)傷性腦損傷模型。

2、
　　2.SD大鼠TBI后連續(xù)7d腹腔注射BrdU以標(biāo)記新生的神經(jīng)細(xì)胞。
　　3.TBI后1、3、7、14、28d應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)大鼠損傷區(qū)皮質(zhì)nestin+/sox-2+神經(jīng)前體細(xì)胞(neural progenitor cells, NPCs)、GFAP+/sox-2+放射狀膠質(zhì)樣細(xì)胞、DCX+/BrdU+神經(jīng)元前體細(xì)胞、MAP-2+/BrdU+新生神經(jīng)元、NeuN+/BrdU+新生成熟神經(jīng)元、GFAP+/BrdU+新生

3、星形膠質(zhì)細(xì)胞、CNP+/BrdU+新生少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生情況。
　　4.TBI后1、3、7、14、28d應(yīng)用TUNEL/BrdU雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)大鼠損傷區(qū)皮質(zhì)新生細(xì)胞的凋亡情況。
　　5.TBI后1、3、7、14、28d應(yīng)用ELISA法檢測(cè)大鼠損傷區(qū)皮質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)的表達(dá)水平。
　　6.TBI后1、3、7、14、28d應(yīng)用高效液相色譜法(h

4、igh performance liquid chromatography,HPLC)檢測(cè)大鼠腦脊液中谷氨酸含量。
　　Ⅱ、體外實(shí)驗(yàn)
　　1.分離培養(yǎng)大鼠TBI后損傷區(qū)皮質(zhì)內(nèi)源性NSCs(neural stem cells,NSCs)并進(jìn)行鑒定,BrdU/Nestin免疫熒光檢測(cè)其胚源性及增殖能力,MAP-2、GFAP、CNP免疫熒光檢測(cè)其多向分化潛能。
　　2.傳至第二代的NSCs行谷氨酸受體NMDA主要功能亞基NR

5、1免疫熒光標(biāo)記,流式細(xì)胞分析NR1陽(yáng)性細(xì)胞百分比。
　　3.傳至第二代的NSCs分空白對(duì)照組(Control)、谷氨酸組(Glu)、Glu+MK-801(0 h)組、Glu+MK-801(24h)組4組分化培養(yǎng):Control組用DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng);Glu組在DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基中加入谷氨酸(5μM)培養(yǎng);Glu+MK-801(0h)組在DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基中加入谷氨酸(5μM)培養(yǎng)同時(shí)加入NMDA受

6、體拮抗劑MK-801(10μM);Glu+MK-801(24h)組在DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基中加入谷氨酸(5μM)培養(yǎng)24 h后加MK-801(10μM)繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)1、3、7、14d后行DCX、MAP-2免疫熒光檢測(cè)NSCs向神經(jīng)元分化情況,TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　4. Control組、Glu+MK-801(24h)組培養(yǎng)1、3、7、14d后,應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)NR1的mRNA表達(dá)情況,Western blo

7、t檢測(cè)NR1的蛋白表達(dá)情況。
　　5.傳至第二代的NSCs接種于Transwell培養(yǎng)體系的上室,分為空白對(duì)照(Control)組、TBI腦組織提取液(Extract)組、SDF-1組3組培養(yǎng):Control組下室加入DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基;Extract組下室加入含有20μl/ml TBI腦損傷組織提取液的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基;SDF-1組下室加入含有200ng/ml SDF-1的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)

8、3d后行Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞遷移情況,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)遷移細(xì)胞的趨化因子受體4(chemokine receptor4,CXCR4)表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　?、?、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1.免疫熒光技術(shù)檢測(cè)損傷區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)發(fā)生結(jié)果:TBI后1、3、7、14d損傷區(qū)周?chē)べ|(zhì)出現(xiàn)nestin+/sox-2+NPCs以及GFAP+/sox-2+放射狀膠質(zhì)樣細(xì)胞,并在3d時(shí)達(dá)到高峰而后下降,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)GFAP+/sox

9、-2+放射狀膠質(zhì)樣細(xì)胞數(shù)量少于nestin+/sox-2+NPCs。傷后1、3、7d觀察到nestin+/sox-2+NPCs從室周帶后區(qū)(posterior periventricular area, PPv)沿胼胝體向損傷區(qū)遷移;傷后3、7、14d損傷區(qū)皮質(zhì)觀察到DCX+/BrdU+神經(jīng)元前體細(xì)胞,7 d時(shí)達(dá)到高峰而后下降;僅在TBI后7、14d損傷區(qū)皮質(zhì)觀察到少量的MAP-2+/BrdU+新生神經(jīng)元,在TBI后1、3、7、14、2

10、8d損傷區(qū)皮質(zhì)均未觀察到NeuN+/BrdU+新生成熟神經(jīng)元;TBI后1、3、7、14、28d損傷區(qū)皮質(zhì)均觀察到GFAP+/BrdU+新生星形膠質(zhì)細(xì)胞,7d時(shí)達(dá)到高峰并一直保持在較高水平;TBI后1、3、7、14、28d損傷區(qū)皮質(zhì)均未觀察到CNP+/BrdU+新生少突膠質(zhì)細(xì)胞;在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),BrdU+細(xì)胞中星形膠質(zhì)細(xì)胞多于NPCs和新生神經(jīng)元。
　　2.TUNEL/BrdU雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)新生細(xì)胞的凋亡結(jié)果:TBI后1、3、7、14

11、d損傷區(qū)周?chē)べ|(zhì)出現(xiàn)TUNEL+/BrdU+凋亡的新生細(xì)胞,TBI后7、14d時(shí)凋亡的新生細(xì)胞數(shù)量多于傷后1、3d,高峰在傷后7d,28 d時(shí)幾乎未見(jiàn)凋亡的新生細(xì)胞。
　　3.ELISA法檢測(cè)損傷區(qū)皮質(zhì)SDF-1的表達(dá)水平結(jié)果:TBI后1d大鼠損傷區(qū)皮質(zhì)SDF-1表達(dá)開(kāi)始升高,3d時(shí)達(dá)到高峰,而后逐漸下降,14、28d時(shí)已接近SHAM組水平。
　　4. HPLC檢測(cè)腦脊液谷氨酸含量水平結(jié)果:TBI組大鼠腦脊液內(nèi)谷氨酸的含量傷

12、后1d即達(dá)到高峰,而后逐漸下降,14d時(shí)已接近SHAM組水平。
　?、?、體外實(shí)驗(yàn)
　　1.成年大鼠TBI后損傷區(qū)皮質(zhì)內(nèi)源性NSCs鑒定結(jié)果:損傷區(qū)皮質(zhì)內(nèi)分離培養(yǎng)出NSCs球?yàn)锽rdU+/Nestin+,并能擴(kuò)增傳代,可以分化為MAP-2+神經(jīng)元、GFAP+星形膠質(zhì)細(xì)胞以及CNP+少突膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.流式細(xì)胞分析NSCs的NR1表達(dá)結(jié)果:成年大鼠TBI后損傷區(qū)皮質(zhì)內(nèi)源性NSCs中,43±1.06％細(xì)胞的谷氨酸受體NM

13、DA主要功能亞基NR1陽(yáng)性。
　　3.谷氨酸對(duì)NSCs向神經(jīng)元分化影響結(jié)果:培養(yǎng)1d時(shí)Glu組、Glu+MK-801(24h)組的DCX+神經(jīng)元前體細(xì)胞明顯多于Control、Glu+MK-801(0h)組;3d時(shí)Glu+MK-801(24h)組DCX+神經(jīng)元前體細(xì)胞最多,Glu組DCX+神經(jīng)元前體細(xì)胞數(shù)量有所下降,但多于Control、Glu+MK-801(0 h)組;至7 d時(shí)Glu+MK-801(24 h)組DCX+神經(jīng)元前

14、體細(xì)胞仍較多,Glu組DCX+神經(jīng)元前體細(xì)胞與Control、Glu+MK-801(0 h)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;14d時(shí)4組幾乎未見(jiàn)DCX+神經(jīng)元前體細(xì)胞,MAP-2免疫熒光檢測(cè)顯示Glu+MK-801(24h)組MAP-2+神經(jīng)元明顯多于其它3組;TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)1d后,4組可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞,3、7、14d時(shí)Control、Glu+MK-801(0h)、Glu+MK-801(24h)組凋亡細(xì)胞數(shù)量與1d時(shí)比較幾乎

15、無(wú)變化,而Glu組TUNEL+凋亡細(xì)胞數(shù)量3d時(shí)達(dá)到高峰,7d、14d時(shí)略有下降但多于其它3組。
　　4.實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)NR1的mRNA表達(dá)情況結(jié)果:Glu+MK-801(24h)組NR1的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì),7 d時(shí)達(dá)到高峰,除7、14d外,其它時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Control組NR1的mRNA相對(duì)表達(dá)量較低,各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Glu+MK-801(24h)組NR1的mRNA相對(duì)表

16、達(dá)量均高于Control組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.Western blot檢測(cè)NR1的蛋白表達(dá)情況結(jié)果:Glu+MK-801(24h)組NR1的蛋白相對(duì)表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì),7d時(shí)達(dá)到高峰,除7、14d外,其它時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Control組NR1的蛋白相對(duì)表達(dá)量較低,各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Glu+MK-801(24 h)組NR1的蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于Control組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

17、br>　　6.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腦損傷組織提取液及SDF-1對(duì)細(xì)胞遷移影響的結(jié)果:Extract組和SDF-1組遷移的細(xì)胞數(shù)量明顯高于Control組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Extract組和SDF-1組遷移的細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3組遷移的細(xì)胞大部分呈現(xiàn)CXCR4陽(yáng)性。
　　結(jié)論:
　　成年SD大鼠TBI后,損傷區(qū)皮質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)NPCs,其一部分來(lái)源于局部激活的放射狀膠質(zhì)樣細(xì)胞,也有部分從PPv區(qū)沿胼胝體遷移而來(lái),

18、TBI后損傷區(qū)內(nèi)高表達(dá)的SDF-1對(duì)其遷移起到了一定的作用;這些NPCs能夠向神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞分化,但前者未能最終發(fā)育為成熟的神經(jīng)元,傷后損傷區(qū)內(nèi)谷氨酸表達(dá)水平的增高既可以促進(jìn)NPCs向神經(jīng)元分化,但也可以促進(jìn)分化過(guò)程中的神經(jīng)元凋亡,后者與神經(jīng)元在發(fā)育過(guò)程中NMDA受體表達(dá)的逐漸升高有關(guān)。
　　第二部分 奧拉西坦對(duì)成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后海馬內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生的影響
　　目的:
　　探討奧拉西坦對(duì)成年大鼠TBI后海馬內(nèi)源

19、性神經(jīng)發(fā)生的影響及其機(jī)制。
　　方法:
　　Ⅰ、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　1.經(jīng)水迷宮訓(xùn)練篩選出達(dá)標(biāo)大鼠,分為空白對(duì)照組(Control)、生理鹽水組(NS)、奧拉西坦組(Oxiracetam)3組:Control組只開(kāi)顱,不制備腦損傷模型;NS組采用顱腦液壓損傷裝置制備TBI模型,TBI后連續(xù)14d定時(shí)每天一次尾靜脈注射無(wú)菌生理鹽水1ml;Oxiracetam組采用顱腦液壓損傷裝置制備TBI模型,TBI后連續(xù)14d定時(shí)每天一次

20、尾靜脈注射含有奧拉西坦(200mg/kg)的無(wú)菌生理鹽水1ml。
　　2.TBI后第15d進(jìn)行連續(xù)4d的定位巡航試驗(yàn),第19d進(jìn)行空間探索試驗(yàn);
　　3.TBI后第20d應(yīng)用DCX免疫熒光檢測(cè)海馬新生神經(jīng)元情況,ChAT免疫熒光檢測(cè)隔區(qū)及Meynert基底核膽堿能神經(jīng)元情況。
　　4.TBI后第20d應(yīng)用ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)海馬ATP含量。
　　5.TBI后第20d應(yīng)用ELISA法檢測(cè)海馬乙酰膽堿(acetylc

21、holine,ACh)含量。
　　Ⅱ、體外實(shí)驗(yàn):
　　1.從大鼠胚腦海馬中分離培養(yǎng)NSCs并進(jìn)行擴(kuò)增,將傳至第二代的NSCs接種于包被多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi),分為空白對(duì)照組(Control)、生理鹽水組(NS)、奧拉西坦組(Oxiracetam)3組: Control組加入DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng);NS組加入含有10μl/ml生理鹽水的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng);Oxiracetam組加入含有4mg/

22、ml奧拉西坦的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)3d后行DCX免疫熒光檢測(cè)NSCs向神經(jīng)元分化情況,并收集細(xì)胞應(yīng)用ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量。
　　2.取大鼠胚基底前腦原基制成單細(xì)胞懸液，在Transwell培養(yǎng)體系中分為空白對(duì)照組（Control）、膽堿能神經(jīng)元組（Cholinergic neuron）、生理鹽水+膽堿能神經(jīng)元組（NS+Cholinergic neuron）、奧拉西坦+膽堿能神經(jīng)元組（Oxirace

23、tam+Cholinergicneuron）培養(yǎng)： Control組下室不接種鼠胚基底前腦原基制備的單細(xì)胞懸液，只加入DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基；Cholinergic neuron組下室接種鼠胚基底前腦原基制備的單細(xì)胞懸液并加入DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；NS+Cholinergic neuron組下室接種鼠胚基底前腦原基制備的單細(xì)胞懸液并加入含10μl/ml生理鹽水的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；Oxiracetam+C

24、holinergic neuron組下室接種鼠胚基底前腦原基制備的單細(xì)胞懸液并加入含有4mg/ml奧拉西坦的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；將從大鼠胚腦海馬中分離擴(kuò)增的NSCs接種于Transwell培養(yǎng)體系的上室，共培養(yǎng)3d后，行ChAT免疫熒光檢測(cè)下室膽堿能神經(jīng)元分化情況、DCX免疫熒光檢測(cè)上室海馬NSCs向神經(jīng)元分化情況，收集各組培養(yǎng)液用ELISA法檢測(cè)ACh含量。
　　3.取大鼠胚基底前腦原基制成單細(xì)胞懸液，接種于包被多

25、聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，分為空白對(duì)照組（Control）、生理鹽水+TBI腦組織提取液組（NS+Extract）、奧拉西坦+TBI腦組織提取液組(Oxiracetam+Extract)，開(kāi)始各組均用DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。第4d換培養(yǎng)液時(shí)，Control組繼續(xù)加入DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基；NS組加入含有20μl/ml腦損傷皮質(zhì)提取液、10μl/ml生理鹽水的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基；Oxiracetam+Ext

26、ract組加入含有20μl/ml腦損傷皮質(zhì)提取液及4mg/ml奧拉西坦的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基，再培養(yǎng)3d，然后行TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞。
　　結(jié)果：
　　Ⅰ、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1.定位巡航試驗(yàn)結(jié)果：Oxiracetam組和Control組大鼠逃避潛伏期少于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.空間探索試驗(yàn)結(jié)果：Oxiracetam組和Control組大鼠平臺(tái)跨越次數(shù)高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3

27、. DCX免疫熒光檢測(cè)海馬齒狀回神經(jīng)元前體細(xì)胞結(jié)果：Oxiracetam組損傷側(cè)齒狀回內(nèi)DCX+神經(jīng)元前體細(xì)胞最多，NS組次之，Control組僅見(jiàn)到少量的DCX+的神經(jīng)元前體細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4. ChAT免疫熒光檢測(cè)隔區(qū)及Meynert基底核膽堿能神經(jīng)元結(jié)果： Control組可見(jiàn)到較多的ChAT+膽堿能神經(jīng)元，Oxiracetam組損傷側(cè)隔區(qū)及Meynert基底核ChAT+膽堿能神經(jīng)元雖有減少但多于NS組，差異有

28、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.海馬ACh含量檢測(cè)結(jié)果：Oxiracetam組海馬ACh含量低于Control組，但高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.海馬ATP含量檢測(cè)結(jié)果：Oxiracetam組海馬ATP含量低于Control組，但高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?、?、體外實(shí)驗(yàn)
　　1. DCX免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)奧拉西坦對(duì)海馬NSCs向神經(jīng)元分化結(jié)果：Control組、NS組、Oxiracetam組均可見(jiàn)少量DCX

29、+神經(jīng)元前體細(xì)胞，各組間DCX+神經(jīng)元前體細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2. ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞ATP含量結(jié)果：Oxiracetam組ATP含量高于Control組和NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3. ChAT免疫熒光檢測(cè)膽堿能神經(jīng)元原代培養(yǎng)結(jié)果： Cholinergic neuron組、NS+Cholinergic neuron組、Oxiracetam+Cholinergic neuron組均可見(jiàn)較多的ChAT+

30、膽堿能神經(jīng)元，3組間膽堿能神經(jīng)元數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Oxiracetam+Cholinergic neuron組ChAT免疫熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；Control組未見(jiàn)ChAT+細(xì)胞。
　　4. DCX免疫熒光檢測(cè)膽堿能神經(jīng)元對(duì)海馬NSCs向神經(jīng)元分化結(jié)果：Oxiracetam+Cholinergic neuron組的DCX+神經(jīng)元前體細(xì)胞最多，Cholinergic neuron組、NS+Cholinergic neuron組的DCX+

31、神經(jīng)元前體細(xì)胞多于Control組，除Cholinergicneuron組和NS+Cholinergic neuron組外，其余兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5. ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中ACh含量檢測(cè)結(jié)果： Cholinergic neuron組、NS+Cholinergic neuron組、Oxiracetam+Cholinergic neuron組培養(yǎng)中均能檢測(cè)到ACh，Oxiracetam+Cholinergic neur

32、on組培養(yǎng)液中ACh含量高于其它2組；Control組未檢測(cè)到ACh。
　　6. TUNEL試劑盒檢測(cè)奧拉西坦對(duì)膽堿能神經(jīng)元免于凋亡的保護(hù)作用結(jié)果：NS+Extract組可見(jiàn)到較多的凋亡細(xì)胞，Control組和Oxiracetam+Extract組只見(jiàn)到少量凋亡細(xì)胞，3組間凋亡細(xì)胞數(shù)量?jī)蓛杀容^差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：奧拉西坦能夠促進(jìn)成年大鼠TBI后海馬內(nèi)源性的神經(jīng)發(fā)生，明顯改善TBI大鼠學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能障礙；奧拉西坦