具有腫瘤靶向的刺激響應(yīng)型聚合物膠束在癌癥治療中的研究.pdf

1、癌癥已然成為嚴(yán)重威脅人類生命的一大殺手，化療是目前治療癌癥的主要手段，然而化療藥物普遍存在著水溶性差、毒副作用大、生物利用度低等缺點(diǎn)。針對(duì)這些弊端，基于納米載體的藥物傳遞系統(tǒng)(DDS)的研究應(yīng)運(yùn)而生。其中，聚合物膠束作為一種最常見(jiàn)的DDS的形式，對(duì)難溶性化療藥物具有很好的增溶作用，并且可實(shí)現(xiàn)藥物的靶向傳遞及控制釋放。本論文旨在構(gòu)建同時(shí)具有腫瘤靶向性及刺激響應(yīng)性的聚合物膠束，對(duì)其進(jìn)行了性能表征、體內(nèi)外腫瘤靶向及治療評(píng)價(jià)。
　　在論文

2、第二章，我們通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)成功合成了溫度敏感的Pluronic F127-聚D，L-丙交酯（F127-PLA，縮寫為FP）共聚物。通過(guò)溶劑揮發(fā)法制備膠束，膠束的LC、EE、粒徑、LCST、不透明溫度和沉淀溫度隨著PLA鏈段的增長(zhǎng)而增大或升高;膠束的CMC隨著PLA鏈段的增長(zhǎng)而減小。酸性和高溫都能加快藥物從膠束中的釋放，然而只有LCST在37℃與40℃之間的FP100膠束具備體溫下維持穩(wěn)定，高溫下快速釋放藥物的理想釋藥特性。因此，我們選

3、擇FP100膠束修飾葉酸用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究，F(xiàn)A-FP100膠束具有與FP100膠束近乎一致的粒徑、形貌、溫敏轉(zhuǎn)變性質(zhì)及釋藥曲線。細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)表明FA-FP100膠束能選擇性的被FR過(guò)表達(dá)的HeLa細(xì)胞吞噬，而低表達(dá)FR的A549細(xì)胞吞噬FP100及FA-FP100膠束的量很少?；钏兰?xì)胞染色和Alamar blue法證實(shí)FP100與FA-FP100空白膠束具有良好的細(xì)胞相容性，在濃度達(dá)到100μg/mL的情況下3T3細(xì)胞與HeLa細(xì)胞仍

4、然具有90％以上的存活率;40℃的高溫顯著增加了兩種載藥膠束對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性。AnnexinⅤ-FITC/PI對(duì)經(jīng)藥物處理的細(xì)胞染色后，F(xiàn)ACS分析細(xì)胞凋亡情況得知，載藥膠束在40℃比在37℃更多的誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。
　　在論文第三章，我們將葉酸分子修飾在PEG-PCL的親水端，DOX通過(guò)酸不穩(wěn)定的腙鍵連接到疏水端，成功合成了一種具有葉酸靶向及pH敏感的鍵合藥物FA-hyd。通過(guò)溶劑揮發(fā)法制得粒徑在70 nm左右、呈球形分

5、布的膠束。FA-hyd在pH5.0腙鍵斷裂，膠束粒徑增大，藥物釋放速率加快，而在中性條件下能夠保持穩(wěn)定。溶血率、凝血時(shí)間、細(xì)胞毒性的數(shù)據(jù)證實(shí)FA-PECL空白膠束具有良好的生物相容性。細(xì)胞吞噬及細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，F(xiàn)A-hyd膠束能夠特異性識(shí)別并殺死FR過(guò)表達(dá)的KB細(xì)胞。藥物體內(nèi)分布表明，F(xiàn)A-hyd膠束顯著增加了藥物在腫瘤部位的聚集并減少在正常組織的濃度。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示FA-hyd膠束的AUC是所有組中最大的，CL、Vd是所有組中最

6、小的，τ1/2β也僅次于FA-cbm膠束，充分說(shuō)明FA-hyd增加了藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間。給予建立有4T1腫瘤模型的Balb/c小鼠連續(xù)治療后，F(xiàn)A-hyd膠束組腫瘤體積增長(zhǎng)最慢，小鼠體重幾乎沒(méi)有變化，存活時(shí)間最長(zhǎng)，表明這種葉酸靶向及pH敏感的鍵合藥物膠束具有最佳的抗腫瘤效果及最高的安全性。治療末期取出小鼠腫瘤，H&E染色顯示FA-hyd膠束組的凋亡特征最為明顯，進(jìn)一步從組織學(xué)水平證實(shí)了其藥效。
　　在論文第四章，我們成功合成了

7、葉酸靶向及pH/還原雙敏感mPEG-PLA-ss-PEI/FA-DMMA(PELE/FA-DA)，MS軟件模擬了PEI與FA的反應(yīng)過(guò)程，證實(shí)了FA更有可能修飾在PEI的末端伯胺上，因此更有利于暴露在膠束外殼以識(shí)別FR，模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)表征高度吻合。PELE/FA-DA膠束有效阻止BSA吸附，因此在血液中具有很好的穩(wěn)定性。PELE/FA-DA在pH6.8酰胺鍵斷裂，膠束粒徑增大，表面電荷由負(fù)電荷反轉(zhuǎn)為正電荷，中性條件下則穩(wěn)定存在;在10 m

8、M GSH作用下二硫鍵發(fā)生斷裂，PEI從膠束表面脫落，粒徑增大，膠束發(fā)生解體。TEM圖像顯示，PELE/FA-DA膠束在pH5.0及10 mM GSH作用下，膠束結(jié)構(gòu)遭到破壞，迅速發(fā)生聚集。在酸性和還原性條件下DOX從膠束中的釋放速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于在中性或未加入還原劑的環(huán)境。PELE/FA-DA膠束在pH6.8比在pH7.4具有更高的細(xì)胞內(nèi)在化率及細(xì)胞毒性。藥物體內(nèi)分布顯示，PELE/FA-DA膠束顯著增加了藥物在腫瘤的聚集并減少在正常組織的

9、濃度。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明PELE/FA-DA膠束的AUC是所有組中最大的，CL、Vd是所有組中最小的，τ1/2β也是最長(zhǎng)的，說(shuō)明PELE/FA-DA膠束明顯增加了藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間。給予建立有4T1腫瘤模型的Balb/c小鼠連續(xù)治療后，PELE/FA-DA載藥膠束組腫瘤體積增長(zhǎng)最慢，小鼠體重略微增加，存活時(shí)間最長(zhǎng)，表明這種葉酸靶向及pH/還原雙敏感的膠束具有最佳的抗腫瘤效果及最高的安全性。治療末期取出小鼠腫瘤，同樣也是PELE/FA

10、-DA載藥膠束組腫瘤抑制率最高，H&E染色和TUNEL染色顯示該組的腫瘤細(xì)胞數(shù)量最少、凋亡特征最明顯，凋亡率也最高，進(jìn)一步從組織學(xué)水平證實(shí)了其藥效。
　　論文最后一章是在第四章的基礎(chǔ)上，通過(guò)調(diào)節(jié)聚合物之間的比例，設(shè)計(jì)了能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞核靶向的聚合物膠束。同樣以mPEG-PLA-ss-PEI-DMMA（PELEss-DA）作為材料骨架，與第四章不同之處在于mPEG與PLA的分子量及比例不同，我們篩選出mPEG5000-PLA4000這一

11、嵌段共聚物，由此形成的膠束PELA具有可自由穿透核孔的尺寸將mPEG5000-PLA4000進(jìn)一步與PEI、DMMA反應(yīng)合成pH/還原雙敏感的聚合物PELEss-DA。通過(guò)溶劑揮發(fā)法制備膠束，粒徑在40 nm左右，LC和EE分別超過(guò)10％和70％。隨著環(huán)境pH值降低，膠束zeta電位從負(fù)電荷反轉(zhuǎn)為正電荷，粒徑也逐漸增大;10 mM GSH作用下膠束粒徑又逐漸減小，2小時(shí)后變得與PELA膠束一樣大小。PELEss-DA經(jīng)10 mM GSH

12、作用后二硫鍵斷裂，PEI殼層從膠束表面脫落。膠束在酸性條件下釋放DOX速率相對(duì)在中性條件下較快。PELEss-DA膠束在pH6.8比在pH7.4能更快的被MCF-7細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞攝取，并且能夠攜載DOX進(jìn)入細(xì)胞核，此外載藥膠束在酸性條件下細(xì)胞毒性更大。AnnexinⅤ-FITC/PI對(duì)經(jīng)藥物處理的細(xì)胞染色后，F(xiàn)ACS分析細(xì)胞凋亡情況得知，PELEss-DA載藥膠束在酸性條件下比其它各組更多的誘導(dǎo)MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡。

13、腫瘤冰凍組織切片的CLSM圖像顯示PELEss-DA載藥膠束在MCF-7/ADR腫瘤的分布量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它各組，并且大部分定位于細(xì)胞核。給予建立有MCF-7/ADR腫瘤模型的Balb/c裸鼠連續(xù)治療后，PELEss-DA載藥膠束組腫瘤體積增長(zhǎng)最慢，裸鼠體重略微增加，存活時(shí)間最長(zhǎng)，說(shuō)明這種核靶向及pH/還原雙敏感的膠束具有最佳的抗腫瘤效果及最高的安全性。治療末期取出裸鼠腫瘤，H&E染色和TUNEL染色顯示該組的腫瘤細(xì)胞核皺縮、破碎，凋亡特征