5-氨基乙酰丙酸表達(dá)體系的構(gòu)建及發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，簡(jiǎn)稱ALA)，是合成吡咯類(lèi)化合物（血紅素、葉綠素、血紅素及維生素B12等）的重要中間體，在動(dòng)植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞中均可合成。ALA因其易分解、在環(huán)境中無(wú)殘留而作為綠色的農(nóng)用化學(xué)品廣泛應(yīng)用于除草劑、殺蟲(chóng)劑以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域內(nèi)有著廣泛的用處。近年來(lái)，因其在光驅(qū)動(dòng)療法治療癌癥上的特殊重要作用而重新引起人們的廣泛的重視，在癌癥治療領(lǐng)域，ALA也有其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)：治療效果好

2、、毒副作用小、治療確切穩(wěn)定。因此在皮膚癌、膀胱癌、直腸癌等各類(lèi)癌癥的臨床治療中應(yīng)用廣泛。ALA的優(yōu)點(diǎn)符合綠色化學(xué)、綠色治療、綠色環(huán)保的宗旨，必將在不遠(yuǎn)的將來(lái)對(duì)人類(lèi)的生活大有助益。
　　目前ALA的合成方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩種，其中化學(xué)合成法因其步驟繁復(fù)、造成的污染嚴(yán)重，產(chǎn)物收率較低等缺點(diǎn)日益被微生物發(fā)酵法所取代。微生物合成ALA的代謝途徑主要有C4途徑和C5途徑兩種，微生物發(fā)酵法是通過(guò)誘變菌株或重組工程菌株，經(jīng)過(guò)優(yōu)化

3、發(fā)酵條件等方法讓微生物經(jīng) C4或者C5途徑其大量積累ALA的方法。
　　本課題以R.palustris（沼澤紅假單胞菌）的hemO基因序列為模板，經(jīng)優(yōu)化后全基因組合成hemO基因，然后設(shè)計(jì)帶有特異性引物NdeⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的上下游引物hemO-FOR以及hemO-REV，擴(kuò)增目的基因然后以NdeⅠ和HindⅢ分別雙酶切載體質(zhì)粒pET-21a和目的基因經(jīng)連接后獲得pET-21a-hemO后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌體中進(jìn)行表達(dá)，

4、篩選陽(yáng)性單菌落后，提取質(zhì)粒雙酶切用于鑒定。同時(shí)將構(gòu)建的基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白ALAS，通過(guò)優(yōu)化各種發(fā)酵條件，確定最適的因素，最大化的提高酶的活性及合成效率，以達(dá)到積累ALA目的。
　　經(jīng)優(yōu)化后確定在IPTG添加量為0.2 mM、誘導(dǎo)后溫度為28°C、甘氨酸添加量為0.06 mol/L、琥珀酸添加量為0.08 mol/L、乙酰丙酸添加量為1.95 mM，葡萄糖添加量1.95 g/L、誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度為28°C

5、時(shí)，ALA產(chǎn)量可到2.35 g/L。
　　本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的通過(guò)物理法（反復(fù)凍融、超聲處理）和化學(xué)法（正己烷、四氯化碳、甲苯）對(duì)重組大腸桿菌細(xì)胞膜進(jìn)行通透性改變，促使前體物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在頻率25 KHZ，功率200 W下超聲處理80 s時(shí)，ALA的產(chǎn)量由2.31 g/L提升至2.63 g/L ALA的增加較對(duì)照組約為14.0％，效果最佳。有機(jī)試劑實(shí)驗(yàn)中添加0.4%的正己烷效果最佳，由2.21 g/L提升到2.62 g/L，較對(duì)照組